绿藻浒苔体细胞原位再生的转录组学解析：与陆生植物体细胞胚胎发生共享深层分子同源性

《Journal of Marine Science and Engineering》：Transcriptomic Analysis of Somatic In Situ Regeneration in Green Macroalga Ulva prolifera (Ulvophyceae, Chlorophyta)

　　

体细胞原位再生（somatic in situ regeneration, SISR）是形成绿潮的藻类浒苔（Ulva prolifera）特有的一种繁殖方式。基于繁殖与发育特征，已有研究推测SISR代表了陆生植物体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis, SE）的早期演化形式，但一直缺乏分子证据。本研究在SISR过程中开展了时间序列RNA-Seq分析，重点关注SE中的关键调控模块，包括植物激素、胁迫响应、表观遗传修饰和转录因子（transcription factors, TFs）。此外，研究人员还将转录组数据与13个具有系统发育代表性的植物基因组进行了同源性分析。结果表明，SISR过程中的整体转录动态与SE高度相似，提示SISR的启动同样需要生长素的快速积累与运输，并涉及大量胁迫响应基因。表观遗传修饰表现出先脱分化、再分化的时序趋势。值得注意的是，在差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）中可检测到大多数SE关键TFs，并表现出与SE中保守的调控关系。结合SISR与SE模块相关基因之间所揭示的同源性，这些发现提示SISR与SE可能在保守分子模块方面具有深层同源性，并利用相似的核心层级调控网络。这提出了SE的潜在分子模块可能在植物登陆之前已经演化的可能性。

研究背景与科学问题

绿潮是大型绿藻爆发性增殖引发的海洋生态灾害。自2007年以来，黄海连续出现大规模绿潮，优势种为浒苔（Ulva prolifera）。繁殖方式是影响绿潮形成的关键因素之一。前期研究发现，漂浮浒苔在遭受饥饿等环境胁迫后，管状藻体表面存活的体细胞可以在原位直接再生出大量幼苗，这种被称为体细胞原位再生（SISR）的繁殖方式与典型的藻体碎片再生不同。进一步的细胞学、发育学和倍性分析提示，SISR可能是陆生植物体细胞胚胎发生（SE）在演化早期的一种形式，但一直缺少分子水平的证据。为此，本研究对SISR过程进行时间序列转录组测序，并围绕SE的关键调控模块进行分析，以期揭示SISR与SE在分子层面的关系。

研究内容与意义

研究人员以浒苔SISR为对象，对从长期饥饿胁迫到营养恢复后细胞再生的连续过程进行了RNA-Seq分析，系统描绘了植物激素、胁迫响应、表观遗传修饰和转录因子（TFs）等模块相关基因的转录动态。同时，将转录组数据与13个从单细胞绿藻到陆生植物中具有系统发育代表性的物种进行同源基因比较。结果表明，SISR的总体转录动态与SE高度相似，二者可能通过保守分子模块共享深层同源性，并利用相似的核心层级调控网络。这提示SE的分子模块可能在植物登陆之前已经出现，对理解植物再生与胚胎发生途径的演化具有重要意义。

关键技术与方法

研究样本为2011年采自江苏连云港近岸的浒苔藻株，经分子标记鉴定后于实验室维持培养；通过停止更换培养基约9个月进行饥饿胁迫诱导SISR，并按细胞形态变化将过程划分为A–D四个阶段，每个阶段设置3个独立生物学重复。主要技术方法包括：①时间序列RNA-Seq，使用Illumina NovaSeq 6000测序，经Trinity组装、CD-HIT聚类和BUSCO评估；②差异表达分析，使用DESeq2筛选DEGs（FDR<0.05，|log₂FoldChange|>1），并进行GO富集分析；③时间序列聚类分析，使用Mfuzz进行模糊C均值聚类，结合ClusterGVis可视化；④RT-qPCR验证DNA甲基化和组蛋白甲基化相关基因表达；⑤同源基因与系统发育分析，使用OrthoFinder将浒苔转录组与13个代表性植物全基因组蛋白序列聚类为直系同源群，MAFFT比对、TrimAl修剪、IQ-TREE构建最大似然树。

主要结果

3.1 显微观察与光合指标

显微观察显示，SISR四个阶段具有明显的细胞形态变化：A期细胞黄绿色且细胞质较少，B期细胞变浅绿并出现外向突起，C期细胞完全变绿并完成第一次平周分裂，D期通过持续分裂形成单列丝状体。结果表明，母藻体上超过90%的细胞均可独立发生SISR并再生新个体。同时，叶绿素a、叶绿素b含量及F_v/F_m、Y(II)、rETR等荧光参数在SISR过程中显著上升，类胡萝卜素含量和非光化学淬灭（NPQ）先降后升，说明光合系统功能的恢复与细胞再生过程同步发生。

3.2 转录组测序与质量评估

对四个阶段共12个cDNA文库进行测序，各样品Q20>98%、Q30>95%。组装获得105,783条unigenes，平均长度743 bp，N50为1292 bp，BUSCO完整性为92%。共有49,316条unigenes获得功能注释，占全部unigenes的46.6%。

3.3 时间序列聚类分析

利用Mfuzz将所有unigenes分为C1–C6六个簇。A期高表达基因富集于光响应、蛋白激酶活性和磷酸中继传感器激酶活性；B期高表达基因富集于核糖体和光合作用；C期高表达基因富集于叶绿素结合和光捕获；D期高表达基因富集于蛋白激酶活性、信号转导、肌动蛋白结合和核酸结合。结果说明SISR期间基因表达呈现清晰的时空顺序。

3.4 DEGs与GO富集分析

相邻阶段比较发现，B vs. A的DEGs数量最多（7072个），说明SISR启动初期需要大量转录调控。C vs. B和D vs. C分别有4920和3845个DEGs。GO富集显示，B vs. A和C vs. B均富集于光合作用光捕获，D vs. C富集于DNA结合、DNA指导的DNA聚合酶活性和MCM复合体，表明后期以DNA复制和细胞增殖为主。

3.5.1 植物激素

生长素合成与运输相关基因（如IGPS、ILR1和多数ABCB）在B vs. A中上调，随后下调；而生长素信号相关基因RBX1和CUL1仅在D vs. C中上调。细胞分裂素合成与信号基因（CYP735A、ARR-B）也在B vs. A中上调，代谢基因CKX在C vs. B中上调。脱落酸合成基因ZEP在B vs. A中下调、D vs. C中上调，SnRK2家族基因从A期到D期逐渐升高。结果表明，生长素和细胞分裂素可能在SISR早期发挥作用，脱落酸主要在后期发挥调控作用。

3.5.2 胁迫响应

大量胁迫响应基因在SISR中差异表达。GLP在B vs. A中上调；多数GST在B vs. A中上调后持续下降；绝大多数HSP在C vs. B中特异性上调；19个POD呈现两种表达类型，一类在早期上调，另一类仅在D vs. C中上调。虽然B期饥饿胁迫已解除，但胁迫响应基因仍在后续阶段大量表达，提示其可能兼具胁迫响应和再生调控的双重作用。

3.5.3 表观遗传修饰

DNA甲基化相关基因（CMT3、DNMT1等）和组蛋白甲基化基因（SMYD、SUVH9等）的表达峰值集中在C期，去甲基化相关基因未检测到显著差异表达。RT-qPCR进一步显示，未受胁迫的健康藻体（0期）中甲基化相关基因表达显著高于SISR各阶段，A期最低。结果表明，SISR中表观遗传修饰呈现先脱分化后分化的时序特征。

3.5.4 转录因子

在51个TF家族中共鉴定到1364个DEGs。除WUS和STM外，文献已报道的可通过单基因异位表达诱导SE的关键TF同源基因（如AIL5、ANT、BBM、WIND、LEC2、FUS3、SERK、AGL15/18、MYB115/118、LEC1、RKD4）均在SISR中被检测到，并表现出与SE类似的时序性上调。例如，AIL5/ANT/BBM同源基因在B vs. A中先上调，AGL15/18、SERK、WIND和FUS3/LEC2在C vs. B中上调，MYB115/118、SERK和RKD4在D vs. C中最后上调。

3.5.5 光合作用

光合作用相关基因在B vs. A中几乎全部上调（2.2至639倍），与F_v/F_m、Y(II)和rETR的变化趋势一致。类胡萝卜素合成基因（CrtZ、DXR、Z-ISO、GGPS、CrtB）在B vs. A中下调后逐渐上调；催化紫黄质转化为玉米黄质的VDE基因表达与NPQ变化趋势一致。结果表明，光合基因表达变化与光合参数及色素含量变化高度同步。

3.6 同源基因分析与系统发育树

OrthoFinder共鉴定出28,579个直系同源群，选取包含SE四个模块特征基因（如ABCB、IGPS、HSP、GST、CMT3、DNMT1、SUVH、FUS3/LEC2、AIL5/ANT/BBM、SERK、MYB115/118、RKD4）的11个直系同源群构建ML树。各系统发育树整体与植物演化关系一致，且均包含具有SE相似转录动态的浒苔DEGs编码蛋白。结果表明，浒苔SISR相关基因与陆生植物SE核心模块基因之间存在明显同源关系。

讨论

讨论部分指出，SISR与SE在植物激素、胁迫响应、表观遗传修饰和转录因子四个模块的基因表达模式上高度相似，支持二者共享保守分子模块。同时，SISR具有独特性：几乎所有体细胞都具有全能性，再生过程起源于单细胞，且不经过愈伤组织阶段，属于直接SE；由于SISR不依赖WUS，而WUS所属的WOX分支仅存在于种子植物中，提示直接SE可能比间接SE更早演化。与浒苔孢子生殖相比，SISR在转录组层面存在显著差异：SISR不涉及鞭毛合成基因表达，类胡萝卜素合成基因和光合色素含量变化趋势也不同，表明两种繁殖方式在分子调控上根本不同。据此，研究人员将SISR的A–D阶段分别对应SE的脱分化、球形胚、心形/鱼雷胚和子叶胚阶段，并命名为脱分化期、再生期、分化期和生长期。

结论

本研究对浒苔SISR进行了时间序列RNA-Seq分析，重点考察了陆生植物SE的四个关键保守调控模块，包括植物激素、胁迫响应、表观遗传修饰和转录因子。结果发现，SISR中这四个模块的基因表达模式与陆生植物SE高度相似。对关键调控模块相关基因的同源分析显示，这些基因在浒苔与陆生植物之间具有明显的同源关系。以上发现表明，SISR与SE可能通过保守的分子模块共享深层同源性，并利用相似的核心层级调控网络，由此提出SE的潜在核心分子模块可能在植物登陆之前已经演化形成。