蒸馏水稀释提高新鲜犬粪便pH测定值

《Animals》：Distilled Water Dilution Increases Measured Fecal pH in Fresh Canine Feces

　　

粪便pH（fecal pH）在犬营养研究中作为肠道发酵的间接指标，但样品制备可能影响测定值。本研究评估了不同粪便-水稀释比例对犬粪便pH测定的影响。研究人员采用五种制备方案评价了来自20只健康犬的37份样品：不稀释直接测量，以及按重量-体积比以1:1、1:2、1:5和1:10的粪便-水比例用蒸馏水稀释。样品制备影响粪便pH（p < 0.0001）。最小二乘均值pH分别为：直接测量6.37，1:1为6.54，1:2为6.71，1:5为6.88，1:10为7.04。随着加水量增加，粪便pH进行性升高，且所有制备方案间差异均显著。回归分析证实，加水可提高实测粪便pH，且该响应采用二次模型比线性模型描述更佳。这些发现表明，加水量是粪便pH测定中的一个相关方法学因素。在评估的方案中，1:1粪便-水比例似乎是常规分析最适合的标准化方法，因为它使用的水量最低，同时为均质化和电极接触提供了充分条件。

粪便pH（fecal pH）是犬营养研究中广泛使用的非侵入性指标，用以间接反映结肠发酵和肠道微生物代谢活动。其生理学基础在于，肠道内糖酵解发酵非消化性碳水化合物产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs），使肠腔环境趋于酸性；而蛋白水解发酵则生成氨、酚类、吲哚等碱性代谢物，可能使pH升高。因此，粪便pH常与SCFA浓度、氨浓度、粪便评分、微生物组成及营养素消化率等指标联合使用，以评估日粮干预对肠道健康的影响。然而，犬粪便pH测定目前缺乏标准化方案，不同研究在样品储存、均质化、电极类型、平衡时间及稀释方式等方面存在较大差异。尤其值得注意的是，粪便样品常需加水稀释以改善均质化和电极接触，但不同研究采用的粪便-水比例差异很大，常见有1:2、1:5和1:10。稀释虽然方便了样品处理，却可能改变样品中有机酸浓度、离子强度、缓冲能力及电化学条件，从而影响实测pH值，导致不同研究结果难以直接比较。已有马属动物的研究显示，加水会影响平均粪便pH及测量变异性，但犬粪便中该效应的方向和幅度尚未得到充分研究。因此，系统评估不同稀释比例对犬粪便pH测定值的影响，对于既往研究结果的解读以及建立标准化检测方案具有重要意义。

研究人员开展了一项以重复测量设计为基础的方法学评价研究。研究在巴西圣保罗大学兽医学院动物营养与生产系宠物营养研究中心（CEPEN Pet）进行，共纳入20只健康成年犬，包括12只比格犬（平均体重10.21 ± 1.21 kg）、6只巴西?（平均体重7.87 ± 1.60 kg）和2只拉布拉多猎犬（平均体重23.90 ± 2.29 kg），所有犬只均饲喂同一种符合FEDIAF营养推荐的商业干粮。粪便采集分两个独立日期进行，间隔20天，共获得37份新鲜粪样。每份粪样经人工均质后，在同一3 g等分试样上依次进行直接测量和逐步加水稀释，制备为1:1、1:2、1:5和1:10四种粪便-水比例（按重量-体积比）。pH测量使用配备穿透电极的数字pH计（Starter 3100C，OHAUS公司），测量前用pH 4.00和7.00缓冲液校准，读数稳定后记录。为保证测量时间不影响结果，每个采集日另设一份时间对照样品，在0、15和30分钟重复测量各稀释比例的pH。统计学上采用线性混合模型，以制备方案为固定效应、嵌套于犬内的粪样为随机效应，通过最小二乘均值比较并用Tukey-Kramer法校正多重比较；同时以加水量为连续变量拟合线性和二次混合效应回归模型，以Akaike信息准则（Akaike information criterion, AIC）比较模型拟合优度。

研究结果部分显示，37份粪样经五种方案测量共获得185个pH数据，整体pH范围为5.83至7.66，总体均值为6.71，标准差为0.39。不同制备方案对粪便pH有极显著影响（p < 0.0001）。直接测量时最小二乘均值pH为6.37，1:1稀释为6.54，1:2稀释为6.71，1:5稀释为6.88，1:10稀释为7.04，五种方案之间两两差异均达到显著水平（p < 0.05）。与直接测量相比，1:1稀释使pH升高0.17个单位，1:2升高0.34，1:5升高0.51，1:10升高0.67，即加水量越大，实测pH越高。时间对照分析显示，在30分钟测量窗口内，各稀释比例的pH变化极小，差异介于0.00至0.03个pH单位之间，表明测量顺序和时间并不会解释主要结果。回归分析进一步验证了加水量的效应：线性混合效应模型显著（p < 0.0001），每增加1 mL蒸馏水，pH估计增加0.02049个单位；二次模型中线性项和二次项均显著（p < 0.0001）。根据AIC值，二次模型拟合优度优于线性模型，拟合方程为：实测pH = 6.4007 + 0.04799D ? 0.0009D2，其中D为添加至3 g粪样中的蒸馏水体积（mL）。该方程显示pH随加水量增加而上升，但上升幅度逐渐减小。

讨论部分指出，稀释引起的pH升高并非由稀释液本身的pH造成，因为所用蒸馏水pH（6.25和6.26）低于所有粪样的实测pH。加水更可能是通过降低可溶性发酵产物（尤其是有机酸）浓度、改变离子强度和缓冲能力以及影响水相中氢离子活度，从而改变电极读数。这一现象在马粪便中已有类似报道，但犬粪便通常为半固体基质，难以获取足量游离液体进行不稀释测量，因此需要采用标准化的稀释方案。直接测量在技术上虽然可行，但受粪便稠度和含水量影响，电极接触和读数稳定性难以保证，更适合作为实验参照而非常规方法。在评估的几种稀释比例中，1:1所需加水量最少，同时能提供充分的均质化和电极接触条件，因此是最适合常规分析的标准化方案。研究者还建议，除稀释比例外，其他分析条件如仪器校准、电极类型、读取稳定标准、采样与分析时间间隔、样品温度等也应统一，并在报告中详细说明，以提高跨研究的可比性。该研究的局限性包括：稀释方案按固定顺序在同一等分试样上依次进行，尽管时间对照支持结果并非由顺序导致，但仍不能完全排除顺序相关效应；另外，所有犬只均健康、饲喂单一日粮且饲养于同一设施，粪便干物质未测定，因此结果可能不适用于其他人群或管理条件。

研究结论部分翻译如下：添加蒸馏水会使实测粪便pH进行性升高。在测试的稀释方案中，1:1粪便-水稀释所需加水量最低，同时为均质化和电极接触提供了充分条件。因此，在所评估的条件下，1:1稀释似乎是常规粪便pH测定最实用的选择。虽然直接测量作为实验参照是有用的，但不太适合常规分析。