《Animals》：Fasting Serum Bile Acid Profiles in Dogs with Food-Responsive and Immunosuppressant-Responsive Chronic Inflammatory Enteropathy: An Exploratory LC–MS/MS Study
编辑推荐：
胆汁酸（BA）代谢紊乱与犬慢性炎症性肠病（CIE）相关，但不同治疗反应组间的空腹血清胆汁酸谱仍未得到充分表征。这项探索性观察性研究分析了随后被分类为食物反应性肠病（FRE；n = 8）或免疫抑制反应性肠病（IRE；n = 5）的犬的治疗前血清，并以四只非匹配的
胆汁酸（BA）代谢紊乱与犬慢性炎症性肠病（CIE）相关，但不同治疗反应组间的空腹血清胆汁酸谱仍未得到充分表征。这项探索性观察性研究分析了随后被分类为食物反应性肠病（FRE；n = 8）或免疫抑制反应性肠病（IRE；n = 5）的犬的治疗前血清，并以四只非匹配的目的性繁育比格犬作为对照。研究人员采用已发表的犬血清方法进行靶向LC–MS/MS分析，获得了15种胆汁酸物种的结果。所有样本由一名对后续分组分配不知情的分析人员在单一批次中完成分析。研究人员使用Kruskal–Wallis检验对每只犬均可定量的八个物种和十个衍生变量进行比较，并在18项总体检验中采用Benjamini–Hochberg校正。胆酸（CA）和非结合型初级胆汁酸浓度在IRE组中高于对照组和FRE组。总初级胆汁酸与次级胆汁酸之比呈现单调的组间排序（对照组 < FRE < IRE；H = 13.76，p = 0.0010，q = 0.0092；epsilon-squared = 0.840），所有经Bonferroni校正的两两比较均显著。一项事后四情景敏感性分析包括提交的零替代分析及三种基于LOD/LOQ的替代方案，重现了相同的18项检验FDR显著集和相同的比值推断。该分析检验了对删失值处理的稳健性，但不构成独立验证。研究结果提示与分组相关的血清胆汁酸模式，但小样本量、临床异质性和非匹配对照排除了诊断或治疗预测性解读。
论文解读
一、研究背景与研究目的
犬慢性炎症性肠病（chronic inflammatory enteropathy，CIE）是一组以持续性或复发性胃肠道症状为特征的异质性疾病，在排除可独立解释临床表现的其他疾病后确立诊断。CIE通常根据治疗反应进行分类，包括食物反应性肠病（food-responsive enteropathy，FRE）、免疫抑制反应性肠病（immunosuppressant-responsive enteropathy，IRE）和无反应性肠病，但这些类别不一定代表截然不同的发病机制。胆汁酸（bile acid，BA）代谢紊乱已被视为连接肠道炎症、微生物失调、上皮功能障碍和免疫信号改变之间的潜在桥梁。胆汁酸除促进脂质吸收外，还通过激活核受体法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）和膜受体TGR5发挥信号功能。在犬体内，胆酸（cholic acid，CA）和鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）在肝脏合成并主要与牛磺酸结合后分泌入肠，大部分在回肠末端被重吸收，少部分进入结肠经微生物转化，包括7α-脱羟基细菌如Peptacetobacter hiranonis将CA转化为脱氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）、将CDCA转化为石胆酸（lithocholic acid，LCA）。已有研究表明，犬CIE常伴有粪便胆汁酸谱改变，包括初级胆汁酸相对富集和次级胆汁酸耗竭，尤其在菌群失调情况下。然而，血清胆汁酸谱在不同治疗反应组间的特征仍缺乏充分表征。本研究受先前在同一批八只FRE犬和四只对照犬中开展的十二指肠黏膜RNA-seq分析启发，该分析发现胆汁分泌KEGG通路富集及胆汁酸轴转录本的协调变化。本研究旨在探索空腹血清胆汁酸谱（包括初级与次级胆汁酸平衡指标）在对照组、FRE犬和IRE犬之间是否存在差异，并特别将分析范围扩展至IRE组。
二、研究设计与主要结论
本研究为一项探索性观察性分析，使用来自临床队列的治疗前血清，该队列并非专门为血清胆汁酸分析而设计或计算效能。研究纳入布达佩斯兽医大学转诊接受上消化道或上下消化道联合内镜检查的客户自有犬，其胃肠道症状持续至少3周。诊断检查包括临床检查、犬炎症性肠病活动指数（CIBDAI）评分、血液学、血清生化、犬胰蛋白酶样免疫反应性（cTLI）、犬胰腺脂肪酶免疫反应性（cPLI）、皮质醇测定、尿液分析、腹部超声、粪便寄生虫学及贾第虫抗原检测。所有临床犬在采样前未接受针对胃肠道疾病的药物治疗，也未进行过结构化治疗性饮食试验。样本在记录的空腹12–24小时间隔后采集，血清分离后于?80°C保存，所有样本经历一次冻融循环后进行分析。治疗反应分类在6–24周随访期间确定：FRE定义为仅采用低过敏原饮食（新型蛋白或水解蛋白饮食）维持至少1个月达到临床缓解；IRE定义为至少三次低过敏原饮食试验均未能诱导临床缓解，随后在泼尼松龙1–2 mg/kg/天治疗至少1个月期间达到缓解。四只临床健康的目的是繁育比格犬作为对照组，采用相同方案采样和处理。研究共纳入17只犬：对照组4只、FRE组8只、IRE组5只。
研究的主要结论包括：IRE犬的CA和非结合型初级胆汁酸浓度显著高于对照组和FRE组；总初级胆汁酸与次级胆汁酸之比呈现对照组 < FRE < IRE的单调组间排序，该比值在全部四种删失数据处理情景下均保持稳健；所有经Bonferroni校正的两两比较均显著。研究同时强调，这些发现仅提示与分组相关的血清胆汁酸模式，由于样本量小、临床异质性和非匹配对照，不能用于诊断或治疗预测性解读。
三、主要关键技术方法
研究人员采用靶向液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法对犬血清胆汁酸进行定量分析，该方法依据Lányi等人已发表的犬血清方法。具体流程为：取500 μL血清加入同位素标记内标混合物，经蛋白沉淀和固相萃取处理；使用独立于17只研究犬的健康犬制备的胆汁酸耗竭血清池作为校准品和质控样本基质。色谱分离采用Shimadzu Nexera超高效液相色谱系统耦合Shimadzu LCMS-8030+三重四极杆质谱仪，使用Kinetex C18色谱柱，14分钟梯度洗脱，电喷雾电离双极性模式，多反应监测。定量采用内标校准和1/C2加权回归。所有研究样本在单一分析批次内完成，分析人员对后续临床分组分配不知情。每个样本-分析物组合进样三次，样本级均值用于后续分析。最终分析输出包含15种胆汁酸物种的结果。样本队列来源为布达佩斯兽医大学的临床转诊犬和目的性繁育比格犬对照。
四、研究结果
4.1 队列特征与临床背景
全部17只犬均在记录的空腹12–24小时间隔后采集治疗前血清。FRE组基线CIBDAI评分中位数[四分位距]为6 [5–7.25]，IRE组为9 [8,9]。FRE组血清白蛋白范围为2.4–3.2 g/dL，IRE组为1.1–3.4 g/dL。FRE组无低白蛋白血症犬；IRE组两只犬存在低白蛋白血症，被认定为疑似炎症性蛋白丢失性肠病。其中一只白蛋白1.8 g/dL、胆固醇108 mg/dL、CIBDAI 10、病程2个月、总初级与次级胆汁酸之比为8.858；另一只白蛋白1.1 g/dL、胆固醇250 mg/dL、CIBDAI 9、病程1个月、伴有腹水、比值为6.490。两只犬均在泼尼松龙治疗期间达到临床缓解。三只正常白蛋白血症IRE犬白蛋白2.8–3.4 g/dL、胆固醇187–221 mg/dL、CIBDAI 5–9、病程6个月至1年、比值为6.292–8.273。组织病理学检查结果异质性较大，主要为轻度非特异性改变，无一致的组织病理学模式可定义任一治疗反应组。
4.2 分析结果、定量状态与进样重复性
全部17只犬均完成血清胆汁酸谱分析。分析数据集包含15种初级和次级、结合型和非结合型胆汁酸物种的结果。八个物种在每只犬中均可定量，纳入个体分析物比较：CA、TCA、CDCA、牛磺鹅脱氧胆酸、DCA、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸和牛磺熊去氧胆酸。LCA在17只犬中的10只可定量，UDCA在5只犬中可定量。五种甘氨酸结合型物种均不可定量。在255个样本-分析物观测值中，151个可定量、69个不可定量、35个未检出。在具有定量结果的物种中，中位分析物特异性进样RSD范围为2.87%–11.15%。最大进样RSD为18.45%（一个牛磺石胆酸结果），其余所有可定量样本-分析物均值的RSD不超过14.21%。甘氨酸结合型胆汁酸不可定量与犬类牛磺酸结合占主导的生物学特征相符，但不可定量不应解释为确认的生物学缺失。
4.3 个体胆汁酸浓度
4.3.1 初级胆汁酸
CA浓度呈现单调组间排序，中位数[四分位距]为对照组615 [356–912] nM、FRE组1010 [782–1742] nM、IRE组2895 [2827–3122] nM。总体差异在FDR校正后仍显著（H = 10.94，原始p = 0.0042，q = 0.0189；epsilon-squared = 0.639）。IRE组CA浓度高于对照组（Bonferroni校正p = 0.0476）和FRE组（p = 0.0047），而FRE组与对照组之间无显著差异。TCA是所有组中含量最高的胆汁酸物种。其他个体初级胆汁酸在FDR校正后均不显著。
4.3.2 次级胆汁酸
DCA和牛磺石胆酸浓度在CIE组中描述性低于对照组，但无任何个体次级胆汁酸在FDR校正后保持显著。牛磺石胆酸的原始总体p值为0.0327，校正后q值为0.1177。牛磺脱氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸未显示组间差异证据。
4.4 衍生胆汁酸变量
4.4.1 总初级、总次级和总测定胆汁酸
总初级、总次级和总测定胆汁酸浓度在FDR校正后组间均无显著差异。
4.4.2 非结合型和牛磺酸结合型浓度及牛磺酸结合率
非结合型初级胆汁酸浓度（CA + CDCA）在FDR校正后组间存在显著差异（H = 11.19，原始p = 0.0037，q = 0.0189；epsilon-squared = 0.657）。中位数[四分位距]为对照组767 [544–1001] nM、FRE组1155 [939–1942] nM、IRE组3096 [3044–3308] nM。IRE组高于对照组（Bonferroni校正p = 0.0476）和FRE组（p = 0.0047），FRE组与对照组无差异。牛磺酸结合型初级胆汁酸浓度、非结合型和牛磺酸结合型次级胆汁酸浓度以及牛磺酸结合率均未显示FDR显著的组间差异。
4.4.3 初级与次级胆汁酸之比
总初级与次级胆汁酸之比呈现单调组间排序，中位数[四分位距]为对照组2.56 [2.54–2.74]、FRE组4.81 [4.20–4.99]、IRE组7.60 [6.49–8.27]。总体差异显著（H = 13.76，原始p = 0.0010，q = 0.0092；epsilon-squared = 0.840），全部三个Bonferroni校正两两比较均显著（对照组vs. FRE，p = 0.0121；对照组vs. IRE，p = 0.0476；FRE vs. IRE，p = 0.0047）。事后删失敏感性分析评估了四种数据处理情景，总初级与次级之比在四种情景下中位数分别为2.560/4.810/7.604、2.557/4.794/7.556、2.556/4.787/7.532和2.552/4.766/7.462。由于所有犬级秩次不变，H = 13.765、原始p = 0.001026、q = 0.009232、观测epsilon-squared = 0.840以及三个Bonferroni校正两两p值（0.012121、0.047619和0.004662）在全部四种情景下均不变。完整FDR显著集也保持不变：CA、非结合型初级胆汁酸、总初级与次级之比以及牛磺酸结合型初级与次级之比。三只正常白蛋白血症IRE犬的总初级与次级之比均高于FRE组的完整范围。
4.5 年龄和体重与初级次级之比的探索性关联
探索性Spearman分析未发现年龄或体重与总初级次级之比在全队列或FRE–IRE合并群体中存在统计学显著关联。这些分析为描述性分析，不构成协变量校正，也不能排除年龄、品种、饲养条件、基线饮食或其他结构性组间差异造成的混杂。
五、讨论与结论
讨论部分指出，IRE犬呈现以CA为主导的非结合型初级胆汁酸浓度升高，而总初级与次级之比在提交的零替代分析和三种基于LOD/LOQ的替代情景中均保持对照组–FRE–IRE的单调排序。比值升高可能反映初级胆汁酸池增大、次级胆汁酸池减小或两者兼有。在本数据中，IRE组CA和非结合型初级胆汁酸浓度的升高表明分子端有重要贡献，而总次级胆汁酸浓度描述性较低但未达FDR显著。血清初级次级之比不应等同于用于表征微生物胆汁酸转化的粪便初级次级之比，因为血清浓度整合了宿主合成、转运、吸收、肠肝循环和清除等多重过程。IRE组CA升高的潜在解释包括肝合成改变、肠道去结合、回肠重吸收或肠肝清除变化，但CYP7A1活性、回肠转运、细菌胆汁盐水解酶活性和肝清除率均未直接测量。牛磺石胆酸在FRE和IRE中描述性低于对照组，但校正后不显著，仅为假设生成性观察。牛磺酸结合率组间无显著差异，不应解读为肝结合能力的直接度量。
研究局限性包括：小样本临床队列、无样本量计算、年轻目的性繁育比格犬对照与异质性客户自有临床犬之间的结构性差异；年龄、品种、饲养条件、基线饮食、疾病严重程度等未测量因素可能对观察到的组间模式有贡献；临床犬在活检和血清采集前食用非治疗性商业饮食且未进行过治疗性饮食试验，但详细产品组成、脂肪含量、零食、补充剂和补充饲料信息不可获得；记录的12–24小时空腹间隔内犬级精确空腹时长不可用；血清仅治疗前单次采样，无法评估纵向或犬内治疗效应；两只IRE犬存在疑似炎症性蛋白丢失性肠病（其中一只伴腹水），疾病严重程度或蛋白丢失可能对IRE表型有贡献；无平行的粪便胆汁酸、微生物组、细菌胆汁酸转化、肝合成、回肠转运或清除测量；三次进样表征的是同一最终提取物的重复性而非独立提取精度；单批次分析由不知情分析人员执行降低了但未消除技术偏倚的可能性。
研究结论为：在这个小型探索性队列中，治疗前空腹血清胆汁酸谱提示非匹配健康对照组与随后分类为FRE或IRE的犬之间存在与分组相关的模式。主要发现是IRE中CA主导的非结合型初级胆汁酸升高，以及总初级与次级之比呈现对照组–FRE–IRE的单调排序，该排序在提交的零替代分析和三种基于LOD/LOQ的替代情景中均持续存在。比值的两侧均有数值贡献，但组分水平推断支持最强的是CA主导的初级升高。四情景分析检验了对删失值处理的敏感性，但不构成独立验证。这些结果补充了共享对照组–FRE队列中先前报道的黏膜胆汁酸轴转录发现，但不建立直接的转录-代谢物关系、因果机制或治疗预测性生物标志物。这些假设生成性发现需要在更大规模的匹配队列中验证。
