SIRT7抑制对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成及脂肪酸组成的影响

《Animals》：Effects of SIRT7 Inhibition on Milk Fat Synthesis and Fatty Acid Composition in Dairy Goat Mammary Epithelial Cells

　　

乳脂是乳汁的关键营养成分，不仅为后代提供能量和免疫保护，而且是山羊奶的重要品质指标。Sirt7是Sirtuins家族中研究最少的成员之一，已被证明在脂质代谢中发挥调控作用。本研究利用Sirt7抑制剂（ID: 97491）研究了Sirt7在奶山羊乳腺上皮细胞（GMECs）乳脂合成和脂肪酸组成中的调控作用。研究人员用Sirt7抑制剂（ID: 97491）处理GMECs，通过CCK-8法检测细胞活力，证实15 μmol/L抑制剂无细胞毒性。采用RT-qPCR、Western blot和GC-MS进行功能分析，发现抑制Sirt7上调了SREBP1、CD36、ACC、SCD1和ELOVL6的表达，而下调了FOXO1和FABP1。在蛋白质水平上，抑制剂降低了Sirt7、FOXO1。此外，抑制Sirt7增加了细胞内脂滴和甘油三酯含量。GC-MS分析表明，抑制Sirt7降低了C11:0；增加了C16:0、C15:0、C20:0、C24:0、C16:1和C18:1n9c；并降低了C20:5n3（EPA）。总之，这些发现表明，药理学抑制Sirt7与SREBP1上调、脂质稳态破坏、甘油三酯积累以及GMECs中脂肪酸组成改变有关。这些结果为Sirt7在乳脂合成中的潜在调控作用提供了初步证据，并为未来的机制研究奠定了基础。

乳脂是乳汁中的天然脂质混合物，以甘油三酯（triglycerides, TGs）为主要成分，约占乳脂总量的95%。乳脂合成发生在乳腺上皮细胞中，涉及营养信号、激素调节和胞内信号网络的整合，以及脂肪酸从头合成、外源脂肪酸摄取和甘油三酯组装与分泌的协调。乳脂以脂滴形式分泌入乳，决定了乳脂肪酸组成、风味和质地等品质性状，因此解析乳脂合成机制对奶山羊乳脂性状的分子育种具有重要意义。Sirtuin家族是一类高度保守的NAD⁺依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，哺乳动物包含Sirt1至Sirt7七个成员。其中，Sirt7是唯一主要定位于核仁RNA聚合酶I转录位点的成员，参与脂质代谢、细胞信号转导和蛋白质合成调控。已有研究显示Sirt7在脂质代谢中的作用具有组织特异性，例如Li等发现肾小管上皮细胞Sirt7过表达可减轻肾脂质过氧化损伤并维持脂代谢稳态，Cho等则揭示Sirt7通过自噬信号通路介导肝脏内质网应激从而调节脂质沉积。然而，目前Sirt7调控脂质代谢的研究多集中于人和小鼠模型，在反刍动物中的研究相对有限，主要涉及炎症调控和遗传多态性，其在奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成中的具体功能和分子机制尚不清楚。为此，研究人员利用Sirt7特异性小分子抑制剂（ID: 97491）处理奶山羊乳腺上皮细胞（GMECs），旨在探究Sirt7对乳脂合成和脂肪酸组成的影响，揭示其潜在调控机制，为奶山羊乳品质性状的遗传改良提供理论依据和新靶点。

研究人员使用前期冻存的GMECs（来源于河南牧业经济学院动物分子遗传学实验室，经Wang等方法纯化鉴定），将第8代细胞以不同浓度Sirt7抑制剂（0、5、10、15和20 μmol/L）处理48 h，通过CCK-8法筛选出对细胞活力无显著影响的15 μmol/L作为处理浓度。采用RT-qPCR检测脂代谢相关基因mRNA表达，Western blot检测Sirt7、FOXO1及p-FOXO1蛋白水平；利用甘油三酯测定试剂盒和油红O染色评估细胞内甘油三酯含量和脂滴积累；通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测细胞中长链脂肪酸组成变化。所有数据经SPSS 26.0和GraphPad Prism进行统计分析，组间比较采用非配对Student’s t检验。

### 3.1 Sirt7抑制剂（ID: 97491）的浓度筛选和效力测试

CCK-8结果显示，与对照组相比，5、10、15 μmol/L抑制剂处理组的细胞活力无显著差异，而20 μmol/L处理组细胞活力显著降低，因此选择15 μmol/L作为后续实验浓度。该浓度下，Sirt7 mRNA表达水平下降15%–20%（p<0.01），蛋白表达水平下降40%–50%（p<0.01），表明抑制剂有效抑制了Sirt7的表达。

### 3.2 Sirt7抑制对GMECs乳脂合成相关基因和蛋白的影响

RT-qPCR结果显示，Sirt7抑制后，调控乳脂合成的关键转录因子FOXO1 mRNA表达显著下降（p<0.05），而SREBP1 mRNA表达极显著上升（p<0.01）。脂质转运和脂解途径中，CD36 mRNA极显著上调（p<0.01），FABP1表达极显著下降（p<0.01）。脂肪酸合成相关基因中，ACC和SCD1转录水平极显著上调（p<0.01），ELOVL6显著上调（p<0.05）。Western blot验证表明，与对照组相比，抑制Sirt7显著降低了总FOXO1蛋白水平（p<0.05），但p-FOXO1/FOXO1蛋白比值无明显变化。

### 3.3 Sirt7抑制对甘油三酯和脂滴的影响

甘油三酯测定结果显示，Sirt7抑制后细胞内甘油三酯含量显著增加（p<0.05）。油红O染色显示，与对照组相比，抑制剂处理后细胞内脂滴数量增多且出现明显聚集（p<0.05）。以上结果表明Sirt7抑制促进了GMECs中的脂质积累。

### 3.4 Sirt7抑制对GMECs脂肪酸合成的影响

GC-MS分析结果显示，与对照组相比，Sirt7抑制显著改变了多种脂肪酸的含量。饱和脂肪酸（SFA）中，C11:0含量显著降低（p<0.05），而C16:0、C15:0、C20:0和C24:0含量显著升高（p<0.05）。单不饱和脂肪酸（MUFA）中，C16:1和C18:1n9c含量显著升高（p<0.05）。多不饱和脂肪酸（PUFA）中，C20:5n3（EPA）含量显著降低（p<0.05）。其余脂肪酸含量无显著变化。

讨论部分指出，Sirt7抑制导致的FOXO1下调可解除其对脂质合成的抑制作用，进而促进甘油三酯积累和脂滴形成；同时，Sirt7抑制通过上调SREBP1激活下游脂肪生成基因（如ACC、SCD1、ELOVL6），并下调FABP1抑制脂解，最终破坏脂代谢稳态并促进细胞内脂质沉积。脂肪酸组成的变化表现为中长链饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸富集，而具有抗炎作用的EPA减少，整体上可能有利于改善乳脂的加工特性和营养品质。该研究仍存在局限性，如仅使用化学抑制剂进行功能缺失验证，缺乏CRISPR/Cas9基因编辑等双向遗传证据，相关分子机制有待进一步阐明。

结论：本研究使用SIRT7抑制剂（ID: 97491）处理GMECs，导致SIRT7表达下调，伴随SREBP1及其下游基因表达改变，细胞内甘油三酯含量显著增加，核周脂滴聚集增强，脂肪酸谱发生系统性重塑。这些结果提示，SIRT7可能参与GMECs乳脂合成的负调控，其抑制作用与甘油三酯积累和脂肪酸重塑相关，可能通过激活SREBP1介导的脂肪生成转录网络实现。综上，本研究为SIRT7在奶山羊乳腺脂质代谢中的潜在调控作用提供了初步证据，并为未来机制研究以及改善乳脂产量和定制功能性乳制品的分子靶点开发奠定了基础。