隔离小体1与血红素加氧酶-1在调控牛乳腺上皮细胞自噬/氧化应激中的相互作用

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：The crosstalk between sequestosome 1 and heme oxygenase-1 in regulating autophagy/oxidative stress in bovine mammary epithelial cells

　　

摘要

牛乳房炎严重损害奶牛健康，主要通过牛乳腺上皮细胞（BMECs）中的氧化应激和自噬失调，最终影响泌乳性能。虽然血红素加氧酶-1（HO-1）已被确认为氧化应激和自噬的关键调节因子，但其与选择性自噬受体隔离子1（SQSTM1/p62）之间的相互作用——作为连接自噬与抗氧化反应的关键介导分子——在乳房炎背景下的机制仍不清楚。我们假设p62通过调节HO-1活性来协调BMECs中的细胞防御机制。为验证此假设，我们建立了p62过表达/敲低细胞系，并用脂多糖（LPS）、外源性HO-1、核因子红系2相关因子2（Nrf2）抑制剂或自噬抑制剂进行处理。结果显示，p62过表达抑制了自噬，同时通过结合Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）激活了Nrf2/HO-1通路。p62-HO-1轴和外源性HO-1协同增强了抗氧化酶表达，降低了活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，并减轻了LPS诱导的促炎细胞因子产生。在机制上，p62-HO-1轴恢复了线粒体膜电位，提高了三磷酸腺苷（ATP）合成，减少了线粒体超氧阴离子积累，并纠正了线粒体动态失衡。重要的是，这些保护效应被发现是自噬非依赖性但Nrf2依赖性的。本研究阐明了一种新机制，即p62-HO-1轴通过整合抗氧化防御与线粒体稳态来保护BMECs，为细菌性乳房炎的发病机制提供了新见解，并确定了潜在的治疗靶点。

引言

牛乳房炎以乳腺炎症为特征，仍然是全球乳业中经济损失最严重的疾病之一[1], [2]。除了与兽医护理和废弃牛奶相关的直接成本外，该疾病从根本上破坏了血液-牛奶屏障的完整性，并诱导牛乳腺上皮细胞（BMECs）分泌机制的不可逆损伤。由于病原菌侵袭的普遍性及其在疾病发生中的作用，细菌性乳房炎是一个主要的研究关注点[3], [4]。细菌成分脂多糖（LPS）是这一病理过程的关键驱动因素，在BMECs中诱导炎症和氧化损伤，导致乳腺组织功能障碍[5], [6]。因此，了解保护BMECs免受炎症攻击的细胞防御机制，特别是那些由LPS等细菌成分触发的机制，对于开发有效的治疗策略至关重要。

核因子红系2相关因子2（Nrf2）信号通路在维持氧化还原稳态中发挥关键作用，通过调节包括血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）在内的抗氧化和解毒基因的表达[7], [8]。在生理条件下，Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）促进Nrf2的胞质降解，从而维持较低的基础水平。在氧化应激下，Keap1发生构象变化，导致Nrf2释放并随后核转位。核内Nrf2与抗氧化反应元件（ARE）结合，驱动细胞保护基因的转录以对抗氧化损伤。这种转录激活增强了细胞抗氧化防御系统，导致活性氧（ROS）水平降低和氧化损伤减轻[9], [10]。氧化损伤引发自噬的适应性上调，以促进受损细胞成分的清除。然而，持续的压力通常会损害自噬流，加剧细胞损伤[11], [12]。HO-1是血红素分解代谢中限速酶的可诱导亚型，已被确认为对抗炎症和氧化损伤的细胞保护因子[13]。新兴证据表明HO-1可以调节自噬活性，但其在上皮细胞中的精确调节方向和机制仍存在争议[14]。虽然一些研究报告HO-1通过AMP激活蛋白激酶（AMPK）/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）通路介导的自噬诱导，但其他研究在特定应激条件下描述其抑制效应[15], [16]。这种模糊性凸显了确定上游调节因子的必要性，以在BMECs的病理生理背景下精细调节HO-1活性。

值得注意的是，选择性自噬受体p62（隔离子1，SQSTM1）已被证明履行超出作为自噬降解货物适体功能的作用[17], [18]。除了在选择性自噬中的作用外，p62通过平衡融合和分裂动态来促进线粒体稳态，从而维持线粒体结构完整性和功能完整性[19]。作为多功能信号支架，p62在激活Nrf2–Keap1抗氧化轴中发挥关键作用[20]。在基础条件下，p62被Keap1隔离并进行蛋白酶体降解。在细胞应激下，积累的p62与Keap1结合，释放Nrf2使其转位到细胞核并转录激活抗氧化基因，包括HO-1[21]。同时，Nrf2激活有助于维持线粒体功能和生物发生，从而限制ROS产生并建立保护性反馈回路[22]。重要的是，p62和Nrf2之间存在直接的正反馈机制：p62通过Keap1隔离促进Nrf2激活，而Nrf2转录上调p62表达，使它们的协调作用能够减轻氧化损伤[20], [23]。

线粒体结构完整性和紧密调节的线粒体动态平衡是稳健的能量代谢和生物合成的先决条件，为细胞对多种应激原的韧性提供支撑[24]。倾向于分裂而非融合的失衡是功能衰退的标志[25]。在神经退行性疾病中，病理性增强的分裂促进线粒体碎片化，从而建立由能量代谢障碍和加剧氧化应激组成的有害反馈回路[26], [27], [28]。值得注意的是，HO-1已被证明参与多方面的线粒体质量控制，包括生物发生、融合和分裂的调节[29]。例如，在心肌细胞中，HO-1过表达减轻了分裂介导因子FIS1的上调，同时促进融合效应因子线粒体融合蛋白1（MFN1）和线粒体融合蛋白2（MFN2）的表达，从而恢复线粒体形态和功能[30]。类似地，HO-1在急性肾损伤模型中通过精细调节线粒体融合/分裂平衡发挥细胞保护作用[31]。此外，HO-1通过优化线粒体功能——具体表现为增强呼吸能力和抑制ROS产生——有助于维持细胞氧化还原平衡[32]。综合来看，这些发现强调了HO-1在各种细胞类型中保护线粒体动态的保守作用，为研究其在氧化应激下BMECs中的功能提供了有力的依据。

然而，HO-1和p62在LPS挑战的BMECs中的功能相互作用仍定义不清，特别是它们对自噬、氧化应激和线粒体完整性的协调调节。为弥补这一空白，我们假设p62和HO-1之间的相互作用在乳房炎发病机制中发挥关键作用。为验证此假设，我们在BMECs中建立了LPS诱导的氧化应激和自噬模型，以H2O2作为阳性对照。我们的发现表明，p62过表达抑制了基础自噬活性，同时通过Keap1相互作用激活了Nrf2通路。这导致抗氧化酶产生增强（例如，超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、过氧化氢酶CAT）以及ROS水平和丙二醛（MDA）含量的显著降低。值得注意的是，这种细胞保护反应伴随着HO-1表达的上调，提示存在正反馈回路。为阐明HO-1是否以互惠方式调节p62功能，我们采用了Nrf2抑制剂ML385和自噬抑制剂3-MA。有趣的是，Nrf2抑制消除了p62介导的自噬抑制，反而揭示了p62的促自噬效应。相反，即使在自噬阻滞条件下，p62仍保留其抗氧化能力，表明其保护效应主要通过Nrf2通路激活而非自噬依赖性机制介导。综合来看，这些数据表明p62-HO-1轴减轻了氧化应激和线粒体损伤，从而缓解了BMECs中的氧化损伤。阐明HO-1和p62之间的分子对话不仅为牛细菌性乳房炎的发病机制提供了新见解，也为确定潜在治疗靶点和控制乳房炎铺平了道路。

分节片段

细胞培养和处理

牛乳腺上皮细胞（BMECs）来源于实验室分离的牛乳腺上皮细胞。牛p62基因（NM_001205519.1）被亚克隆到pPB-EF1α真核表达载体（海兴生物科技有限公司）中，以产生稳定的p62过表达BMECs（pPB-p62，图S1），详细方法见补充文件。这些细胞在含有10%胎牛血清（FBS，ExCell Bio）的杜尔贝科改良鹰氏培养基（DMEM，HyClone，SH30022.01）中培养

p62–Keap1相互作用介导Nrf2/HO-1轴的激活

牛乳房炎的发病机制涉及炎症、氧化应激和自噬的复杂机制[5], [6]。HO-1是由Nrf2调节的细胞保护酶，在减轻氧化损伤中发挥关键作用[7], [8]。p62已被鉴定为通过其结合Keap1来调节Nrf2激活的调节因子[17]。通过共免疫沉淀确认了内源性p62–Keap1相互作用（图1A）。为阐明p62和HO-1之间的功能联系，用...挑战BMECs

讨论

牛乳房炎主要由微生物感染引起，由于产奶量和奶质下降造成重大经济损失。越来越多的证据表明，BMECs中过量ROS积累是乳房炎炎症的关键驱动因素[45], [46]。值得注意的是，与广泛接受的共识——炎症应激促进Nrf2激活和HO-1上调[13], [47]相反，本研究表明LPS刺激降低了Nrf2和HO-1的表达，同时

结论

本研究阐明了BMECs中的一种精密调控回路，即p62-Nrf2-HO-1轴协同防御LPS诱导的氧化应激、炎症和线粒体功能障碍（图10）。我们证明，虽然LPS触发有害的氧化损伤和过度自噬，但细胞反应受p62的双重功能角色支配。在机制上，p62通过结合Keap1促进Nrf2核转位，随后通过...表达HO-1

AI使用声明

我确认本文稿符合期刊关于生成式AI使用的指南，如作者指南中所述。我使用了AI进行语言润色。

CRediT作者贡献声明

李和平：撰写——初稿、验证、项目管理、调查研究、资金获取、形式分析、概念化。张心怡：方法论、调查研究、形式分析、数据整理。刘晓晓：形式分析、数据整理。杨启龙：方法论、调查研究。彭代：方法论、形式分析。曹瑞：方法论、调查研究。罗思佳：方法论、调查研究。孙向顺：可视化、软件。宋磊：软件、数据整理。

患者发表同意

不适用。

伦理批准和参与同意

本文不包含任何作者进行的人类或动物研究。所有实验方案均经河南农业大学动物兽医学院伦理委员会（中国郑州）批准。

利益冲突声明

作者声明他们与本稿件不存在竞争或利益冲突。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（32272958，32172809）和河南省自然科学基金（262300421487）的资助。资助机构在研究设计、数据收集、解释或提交发表的决定中不起作用。

李和平 | 张心怡 | 刘晓晓 | 杨启龙 | 彭代 | 曹瑞 | 罗思佳 | 孙向顺 | 宋磊 | 韩英乾 | 刘洋 | 王悦颖

农业农村部动物生物化学与营养重点实验室，河南农业大学动物医学院，河南郑州450046，中国