《Applied and Environmental Microbiology》：Loss of Ku70 promotes mononucleate conidiation and homologous recombination in Phanerochaete chrysosporium
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木质素是木本纤维素的主要成分，也是地球上最丰富的芳香族生物聚合物。它为植物提供刚性和保护，但其顽固特性也为木质纤维素的增值转化构成了重大障碍。白腐真菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是自然界最高效的木质素降解菌之一，其木
木质素是木本纤维素的主要成分，也是地球上最丰富的芳香族生物聚合物。它为植物提供刚性和保护，但其顽固特性也为木质纤维素的增值转化构成了重大障碍。白腐真菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是自然界最高效的木质素降解菌之一，其木质素分解能力已被广泛研究。精确的基因组编辑对于阐明其木质素分解作用的体内机制至关重要，但黄孢原毛平革菌的遗传操作常常受到不精确性的困扰。这一技术难题主要由经典非同源末端连接（canonical non-homologous end joining, c-NHEJ）途径驱动，该DNA修复系统几乎不需要同源性，且依赖于Ku70/Ku80异源二聚体与双链断裂（double-strand break, DSB）末端的结合。在许多丝状真菌中，Ku70或Ku80的缺失可消除c-NHEJ并显著提高基因组编辑精度，但在黄孢原毛平革菌中尚未得到验证和利用。研究人员在遗传背景清晰的减数分裂同核体中构建了纯合ku70Δ突变体。Ku70缺失对生长影响极小，但使同源重组频率从约2%显著提高至约66%，其中约32%为纯合型。出乎意料的是，Ku70缺失还促进了单核分生孢子的形成，这可能有助于纯合突变体的分离。综上所述，该研究为理解和利用黄孢原毛平革菌卓越的木质素分解能力提供了宝贵的遗传工具。
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一、研究背景与问题
木质纤维素是植物生物质的主要成分，也是化学品和能源的最大可再生资源。其中木质素是地球上第二丰富的生物聚合物，由单木质醇通过自由基缩合形成，赋予植物刚性和保护作用，但其顽固性也阻碍了木质纤维素的增值利用。白腐真菌（WRF）因能使木质纤维素材料漂白而被统称为白腐真菌，它们具有独特的木质素解聚和利用能力。在众多白腐真菌中，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是研究最深入的一种，能将木质素相关化合物完全矿化为二氧化碳。其木质素降解体系包括木质素过氧化物酶（LiPs）、锰过氧化物酶（MnPs）、产生H?O?的辅助氧化酶以及进一步代谢木质素相关化合物的酶类。尽管这些酶已得到深入的生化表征，但它们在体内对木质素降解和利用的贡献仍缺乏研究。此外，黄孢原毛平革菌的木质素分解似乎是受调控的次级代谢过程，通常在对氮、碳或硫饥饿时被激活，并与环磷酸腺苷（cAMP）水平上升同步，但潜在调控机制仍不清楚。
从基础研究和转化研究的角度来看，理解黄孢原毛平革菌木质素分解的体内机制及其复杂调控具有重要意义，这需要精确的基因组编辑工具。上世纪80年代末，Gold团队建立了基于原生质体的转化方法，但转化DNA常通过非同源重组整合到基因组中，导致编辑不精确。这种不精确性并非黄孢原毛平革菌独有，而是丝状真菌、动物和植物中普遍存在的问题。其根源在于非同源末端连接（NHEJ）修复途径，尤其是经典NHEJ（c-NHEJ），它由Ku70/Ku80异源二聚体结合双链断裂末端启动。在粗糙脉孢菌等丝状真菌中，缺失Ku70或Ku80可大幅提高同源重组频率，但在黄孢原毛平革菌中尚未有相关研究。此外，早期转化依赖的Novozyme 234酶已停产，亟需替代方案。因此，本研究旨在建立高精度的基因组编辑工具，并通过失活c-NHEJ来提高基因敲除效率。
二、研究内容与主要结论
研究人员首先分离了黄孢原毛平革菌的减数分裂同核体，并通过全基因组测序明确了其遗传背景。随后，他们使用国产溶壁酶（Lywallzyme）替代停产的Novozyme 234，重新建立了原生质体转化体系。在此基础上，研究人员构建了纯合ku70Δ突变体，发现Ku70缺失对菌丝生长影响极小，但显著提高了同源重组频率，使mnp1基因的敲除效率从约2%提升至约66%，其中约32%为纯合型敲除。出乎意料的是，Ku70缺失还促进了单核分生孢子的形成，而回补实验证实了该表型确实由ku70缺失引起。该研究首次揭示了c-NHEJ在调节分生孢子核数目中的作用，为黄孢原毛平革菌的基因功能研究和工业菌株改造提供了重要工具。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：（1）通过诱导产孢获得减数分裂同核体，再利用lipI基因PCR和全基因组测序进行遗传背景鉴定；（2）以Lywallzyme替代Novozyme 234制备原生质体，建立基于PPT（草铵膦）筛选的转化体系；（3）利用5-氟乳清酸（5-FOA）筛选尿嘧啶营养缺陷型，获得ura3或ura5突变体，作为第二个筛选标记；（4）构建ku70敲除盒和mnp1敲除盒，通过同源重组实现基因缺失；（5）使用荧光显微镜和荧光激活细胞分选（FACS）分析分生孢子核数目；（6）采用RT-qPCR、qPCR、限制性酶切等分子生物学方法验证突变体和拷贝数。
四、研究结果
1. 减数分裂同核体的分离
研究人员从BKMF-1767异核体诱导产孢，获得单孢子分离物B1和B3。通过lipI基因PCR分析，二者均为同核体（仅含较大片段）。全基因组测序显示B1和B3与参考菌株RP-78高度相似，仅存在少量SNP/indel和结构变异，且B1和B3之间几乎无法区分。唯一确定差异是B1中Scaffold 6上一个位于基因_6426假定3'UTR的T→C突变，该突变未影响生长和产孢。因此，B1和B3是遗传背景高度相似的减数分裂同核体。
2. 原生质体转化体系的重建
研究人员使用Lywallzyme制备原生质体，4小时后开始出现原生质体，8小时达到平台期。所得原生质体对SDS敏感，表明去壁成功。比较不同渗透压稳定剂，0.4 M MgSO?再生效果最佳。对多种筛选试剂敏感性测试显示，PPT是唯一有效抑制剂。构建了由内源gpd启动子驱动bar基因的载体pHW8，线性化后转化获得PPT抗性转化子，但PCR诊断显示整合方式为非重组型，说明需要进一步优化。
3. Ku70缺失促进单核分生孢子形成
通过BLAST搜索鉴定到一个假定的Ku70同源物（蛋白ID 6342975），构建ku70敲除盒（bar基因两侧为ku70同源臂）转化B1，筛选到纯合ku70Δ突变体。诊断PCR和SfoI酶切确认ku70位点被完全替换，RT-PCR和RT-qPCR确认无ku70转录本。菌丝生长与野生型几乎一致，但孢子产量略低。DAPI染色和FACS分析显示，野生型以双核分生孢子为主，而ku70Δ中单核分生孢子比例显著升高，三核孢子几乎消失。回补实验（在amyl位点插入ku70）使单核比例恢复至野生型水平，证实ku70缺失是导致该表型的原因。
4. Ku70缺失显著提高同源重组频率
以mnp1为靶点，构建mnp1敲除盒（两侧为mnp1同源臂，中间为粟酒裂殖酵母ura3基因，sc_ura3）。在野生型背景下，三个ura?菌株的HR频率仅为约2%（1/54），且仅有一个杂合敲除。而在ku70Δ背景下，三个ura?菌株的HR频率均≥50%，总频率约66%（31/47），其中约32%（10个）为纯合敲除。通过oHW320/oHW321引物检测非重组整合，发现HR与非HR基本互斥；qPCR拷贝数分析显示多数敲除菌株无多拷贝整合。这一结果证明失活c-NHEJ可显著提高黄孢原毛平革菌的基因靶向效率。
五、讨论与结论
本研究首次在黄孢原毛平革菌中实现了ku70的纯合敲除，并证明其能将同源重组频率从约2%提升至约66%，为精确基因组编辑提供了可靠工具。研究人员指出，尽管ku70缺失使HR成为主导修复途径，但未达到100%，可能是由于存在Ku非依赖性替代末端连接途径。未来可尝试延长同源臂或开发CRISPR-Cas9系统进一步提升编辑效率。此外，研究意外发现c-NHEJ参与调控分生孢子核数目，这是此前未报道的。黄孢原毛平革菌的分生孢子通常以双核为主，而ku70缺失导致单核孢子增多，该现象可能与有丝分裂或核迁移异常有关，具体机制尚待深入探索。该工作不仅为理解黄孢原毛平革菌的木质素分解机制提供了遗传工具，也为工业应用构建高产菌株奠定了基础。
综上所述，研究人员通过重建原生质体转化体系和失活c-NHEJ，显著提高了黄孢原毛平革菌的基因敲除效率，并揭示了c-NHEJ在分生孢子核数目调控中的新功能。该研究为真菌遗传学、木质素降解机制和工业生物技术领域提供了重要的方法学贡献。
