两步光照发酵策略选育高产灵菌红素粘质沙雷氏菌GEN-M54的研究

《BioDesign Research》：Breeding of Serratia marcescens GEN-M54 for High Prodigiosin Yield Via Two-Step Light Fermentation

　　

灵菌红素（Prodigiosin）是一种基于三吡咯结构的微生物色素，具有抗氧化、抗菌及抗癌等多种生物活性。此外，其具备优异的色牢度与上染率，在医药、化妆品及染料工业中具有广阔的应用前景。本研究通过连续物理与化学诱变，获得了一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）突变株GEN-M54。研究人员考察了光照对灵菌红素合成的影响，并开发了一种两步顺序光照发酵策略以促进灵菌红素的积累。此外，通过基因转录分析，阐明了红光胁迫条件下灵菌红素前体合成代谢通量的变化。最终，通过两步发酵策略，灵菌红素产量达6623.1 mg/L，含量达471.4 mg/g，较对照分别提高了77.1%和46.8%。总体而言，本研究为未来灵菌红素的生产提供了一个高效的微生物平台及高效的发酵策略。

论文解读：基于两步光照发酵策略的高产灵菌红素粘质沙雷氏菌GEN-M54选育与代谢调控研究

一、研究背景与科学问题

灵菌红素（Prodigiosin，PG）是一种具有三吡咯环共轭结构的天然红色微生物色素，兼具抗氧化、抗菌、抗真菌、抗疟及抗癌等多种生物活性，同时具备优异的染色牢度与上染率，在医药、化妆品及环保染料领域具有广阔的应用前景。随着全球天然色素市场需求持续增长，预计到2029年市场规模将达到28亿美元，年复合增长率为4.67%。然而，化学合成法因反应效率低且存在环境问题而受到限制，微生物细胞工厂因其天然合成能力与可规模化特性而成为更具吸引力的替代方案。粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是当前研究最为深入的灵菌红素生产底盘菌株，但其天然产量远不能满足工业化需求。现有研究多集中于发酵条件优化或异源表达，但受限于遗传操作工具缺乏及对灵菌红素生物合成关键限速步骤认识不足，通过基因改造提升产量的效果有限。近年来，动态代谢调控策略因其能够在发酵过程中实现细胞生长与产物合成的时序解耦而受到关注。因此，开发高产灵菌红素的底盘菌株并实施高效的动态发酵策略，对于实现灵菌红素的高水平生产至关重要。

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员从南京工业大学镜湖土壤样本中分离获得一株产灵菌红素的野生菌株GEN-01，经16S rRNA基因测序鉴定为粘质沙雷氏菌。随后采用常压室温等离子体（ARTP）、亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）三种物理与化学诱变剂，开展了五轮循环诱变育种，最终获得高产突变株GEN-M54。与野生型相比，该突变株的灵菌红素产量和含量分别提高了54.1%和10.6%，且经连续五次传代后产量表型保持稳定。在此基础上，研究人员通过单因素实验系统优化了碳源、氮源、脯氨酸及Fe2?浓度等发酵参数，确定了最优培养基组成。进一步研究发现，红光光照能够显著促进灵菌红素的合成，且光照强度为500 lux、发酵24小时后开始光照并持续48小时的两步顺序光照策略效果最佳。在5.0 L生物反应器中应用该策略，灵菌红素产量达到6623.1 mg/L，含量达471.4 mg/g，较黑暗对照分别提高77.1%和46.8%。转录分析表明，红光胁迫诱导细胞内活性氧（ROS）水平上升，进而上调了灵菌红素合成基因簇中* pigC、pigD、pigL和pigG*等关键基因的转录水平，增强了前体MBC和MAP的合成代谢通量及二者的缩合效率，最终促进了灵菌红素的高效积累。该研究首次系统阐明了光照作为外部可控信号在灵菌红素生物合成中的调控作用，为动态光控发酵策略的开发提供了理论基础和实践依据。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：从南京工业大学镜湖采集土壤样本进行菌株分离与16S rRNA基因鉴定；采用ARTP、EMS和NTG三种诱变剂进行循环物理化学诱变育种；通过全基因组测序与基因注释分析突变株基因组特征；利用qRT-PCR技术分析光照条件下灵菌红素合成基因簇的转录水平变化；使用DCFH-DA荧光探针测定胞内ROS水平；在5.0 L生物反应器中开展补料分批发酵并实施两步顺序光照策略；采用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）对灵菌红素进行定性与定量检测。

四、研究结果

4.1 产灵菌红素菌株的分离与鉴定

研究人员从土壤样本中分离获得一株红色素产生菌GEN-01，经HPLC-MS鉴定其主要色素产物为灵菌红素。16S rRNA基因序列分析显示该菌株与粘质沙雷氏菌ATCC 13880具有99.9%的同源性。菌株在30°C、初始pH 7.0条件下生长最佳，72小时培养后OD₆₀₀值达17.4。该菌株对青霉素、万古霉素、克林霉素、氨苄青霉素及麦迪霉素具有耐药性，但对氯霉素和卡那霉素敏感，有利于后续分子生物学操作。

4.2 联合物理化学诱变育种

研究人员通过绘制致死率曲线确定了ARTP（30秒）、EMS（40分钟）和NTG（4分钟）的最适处理时间，致死率分别为94.6%、92.9%和92.4%。经过五轮循环诱变后，获得突变株GEN-M54，其OD₆₀₀值达47.9，较野生型提高25.7%；灵菌红素产量为1589.4 mg/L，含量为295.5 mg/g，分别提高54.1%和10.6%。连续五次传代后产量表型稳定。

4.3 发酵条件优化

以20.0 g/L葡萄糖为碳源时，灵菌红素产量和含量分别达2060.3 mg/L和328.3 mg/g。以16.0 g/L大豆蛋白胨为氮源时，产量达3486.5 mg/L。添加7.5 g/L脯氨酸时，OD₆₀₀值达106.2，产量和含量分别为3451.3 mg/L和358.3 mg/g。添加1.0 mM Fe2?时，OD₆₀₀值提高至123.2，产量和含量分别达3915.7 mg/L和323.6 mg/g。

4.4 光照对灵菌红素合成的影响

红光光照效果最为显著，使灵菌红素含量提高11.7%至361.5 mg/g，产量提高23.7%至4841.9 mg/L。500 lux为最适光照强度。光照2天（24-72小时）效果最佳，产量和含量分别达5001.4 mg/L和398.5 mg/g，较对照提高28.8%和24.4%。全基因组测序显示GEN-M54基因组包含5,315,355 bp，GC含量59.4%，注释到5,032个蛋白编码序列及14个灵菌红素合成相关基因（pigA-pigN）。红光照射使胞内ROS水平升高93.5%，而随着灵菌红素产量增加，ROS水平下降23.4%。qRT-PCR分析表明，光照24小时后* pigC、pigD、pigL和pigG*的转录水平分别上调5.9倍、10.8倍、8.5倍和9.5倍；光照48小时后仍分别保持8.9倍、7.2倍、5.8倍和6.9倍的上调水平。

4.5 5.0 L生物反应器中的两步顺序光照发酵

在5.0 L生物反应器中，前24小时保持黑暗培养以促进菌体生长，24小时后施加500 lux红光光照。发酵72小时结束时，灵菌红素产量达6623.1 mg/L，含量达471.4 mg/g，较黑暗对照分别提高77.1%和46.8%。

五、讨论与结论

研究人员指出，尽管两步光照发酵策略显著提升了灵菌红素产量，但单因素优化方法无法考虑碳氮比、氨基酸与金属离子等关键变量间的交互作用，未来可采用响应面法（RSM）进行系统优化。此外，5.0 L反应器中菌株生长未显著提升，可能与粘质沙雷氏菌的群体感应（QS）系统及表面活性剂产生导致的泡沫抑制通气效率有关，未来可通过基因编辑抑制QS系统和表面活性剂合成来进一步提高生物量。由于未对野生型菌株进行基因组测序，GEN-M54增强表型的具体遗传突变尚无法确定，未来需通过比较基因组学分析鉴定候选突变基因并进行功能验证。

研究结论表明，本研究成功分离了天然粘质沙雷氏菌产灵菌红素菌株，并通过物理化学诱变显著提升了其合成能力，获得稳健突变株GEN-M54。通过系统优化发酵参数，建立了先黑暗培养24小时再红光光照48小时的两步顺序光照发酵策略，实现了生长与代谢的协同优化。在5.0 L生物反应器中，灵菌红素产量和含量分别达6623.1 mg/L和471.4 mg/g，较对照提高77.1%和46.8%。转录分析揭示了红光胁迫通过上调前体合成关键基因转录水平、增强代谢通量及前体缩合效率来促进灵菌红素合成的调控机制。该研究首次建立了光照暴露与灵菌红素生物合成之间的联系，揭示了光诱导氧化应激作为动态代谢调控信号的潜力，为高效生产灵菌红素提供了新型动态光控发酵策略，并展示了GEN-M54作为高效微生物底盘菌株的应用价值。