基于人工智能的低共熔溶剂与极端酶协同设计用于生物催化：反应介质与酶的联合优化最新进展

《BioDesign Research》：Recent Advances in AI-Driven Deep Eutectic Solvent Design for Biocatalysis: Co-design of Extremozyme and Reaction Medium

　　

低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DES）已成为非水相生物催化中替代传统有机介质的可持续且高度可调的绿色溶剂。DES能够与酶动态相互作用，从而改变反应平衡、增强热稳定性并调节立体选择性。然而，DES的巨大组合空间及其复杂的物理化学性质使得传统的试错型溶剂工程策略效率极低。本综述系统考察了DES驱动生物催化领域的最新进展，并突出强调了人工智能（artificial intelligence, AI）在DES理性设计中的作用。具体而言，本综述综合了相关证据，表明DES组成与水含量共同塑造了酶特异性微环境，进而影响催化性能。此外，极端酶（extremozymes）被评估为DES介质中候选催化剂，并被视为可能向酶工程转移的适应性特征的来源。本综述进一步讨论了AI如何支持DES形成筛选、基于定量结构-性质关系（quantitative structure-property relationship, QSPR）模型预测物理化学性质，以及在溶剂层面生成候选配方。在系统层面，研究重点转向预测特定酶在给定配方中的活性与稳定性响应。最后，本文提出一个基于机理的多目标框架，该框架将DES组成、酶序列与结构、操作条件与物理化学计算、AI预测及实验验证相结合，为真正的DES-酶协同设计提供了一条实用路径。

1. 引言

生物催化是现代科学最深刻的进展之一。酶具有出色的底物特异性以及化学、区域和立体选择性，无需活化和保护步骤，能以最少的废物实现高效级联反应。传统生物催化主要在水介质中进行，因为历史上认为酶需要大量水环境来维持活性三维结构。然而，水环境对许多工业相关底物不利，且产生大量废水。近二十年来，非水介质研究逐渐转向离子液体（ionic liquids, IL）和低共熔溶剂（DES）等可持续、非挥发性溶剂替代品。DES通常由氢键受体（hydrogen bond acceptor, HBA）和氢键供体（hydrogen bond donor, HBD）以特定摩尔比物理络合形成，形成致密的三维分子间氢键网络，宏观上表现为熔点显著低于各前体。DES与IL共享有利宏观性质，但因由廉价可生物降解组分制备而更具环境可持续性。天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvents, NADES）完全由天然成分组成，广泛存在于生物体中，可构成细胞内不同于水和脂质的“第三液相”。DES在生物催化中的应用可增溶疏水性底物、提高酶活性和稳定性并增加反应产率。然而，DES基生物催化系统的广泛实施仍受物理化学和方法学限制。传统试错方法不再可行，AI辅助策略为优先筛选候选DES并关联活性、稳定性和选择性提供了理性途径。此外，极端酶对极端环境具有耐受性，是研究DES-酶系统的重要模型。

2. DES在生物催化中的应用

目前亲水性DES占DES-酶协同系统的大多数，集中于胆碱盐或甜菜碱-多元醇配方。在DES-酶相互作用中，酶性能由DES组分分子性质和介质整体物理化学性质共同决定。水活度和酶水合状态是最基本的酶相关变量，决定功能性蛋白水合壳能否维持。HBA和HBD的性质通过影响蛋白表面和活性位点附近的离子及氢键环境来影响化学相容性。粘度和扩散系数调节底物、产物和辅因子的传质。介质的pH和极性影响活性位点质子化、分子电荷状态、底物分配和酶稳定性。合适的DES-酶系统核心挑战在于配方是否为酶创造适当微环境，其中水合状态最为重要。由于配方变化同时影响多个耦合性质和竞争性能指标，识别最佳酶微环境是一个多目标优化问题，传统实验筛选难以应对。目前AI应用主要是在预定义候选空间内进行正向筛选，而非真正的逆向生成设计。DES在生物催化中的作用可分为改善底物溶解性和酶活性、调节酶稳定性、调整立体和区域选择性三个方面。

2.1 调节生物催化反应性能

含DES介质可在高底物载量下支持生物催化反应。例如，含50%水的ChCl:甘油（1:2）DES在300 mM底物载量下支持枯草芽孢杆菌酚酸脱羧酶催化咖啡酸脱羧，终点转化率超过99%。另一种DES中二氢杨梅素溶解度比DMSO高1.73倍，优化介质后转化率从18.8%提高至91.3%。调节水含量可维持合适的酶微环境，如ChCl:Gly（1:9）含20%水为马肝醇脱氢酶提供足够底物增溶同时保持活性，肉桂醛还原产率达15.3 g L^-1 d^-1。含60% glyceline的介质平衡了氢化酶活性与氧耐受性，在空气下维持H₂释放72小时，总转换频率60 s^-1。DES还可通过调节酶构象增强催化性能，如辣根过氧化物酶在DES中α-螺旋含量更高。DES组分可直接参与反应形成反应性低共熔溶剂（reactive deep eutectic solvent, RDES），如含甘油或乙二醇的DES创造富羟基微环境，抑制磷脂酶D水解副反应并提高磷脂酰丝氨酸产率。AI辅助筛选应被视为层级过程，而非单一溶解度预测任务。已有研究利用分子动力学（MD）衍生的氢键数和寿命训练机器学习分类器区分DES与非DES系统，最佳extra trees森林模型ROC-AUC达0.88。基于Transformer的二元分类器可预测候选组分和摩尔比是否形成稳定NADES，10个最高排名含布洛芬配方中有8个实验形成稳定混合物。但这些模型主要处理DES形成初步筛选，未联合预测底物载量和催化性能，也未明确纳入酶构象、水合、传质或竞争反应路径等机制变量。

2.2 调节酶热稳定性

多数工业酶来自真菌或中温细菌，限制其耐高温能力。DES可增强酶热稳定性同时保持催化活性。HBA和HBD组分选择影响酶热稳定性，如含10% ChCl:Gly（1:2）的磷酸盐缓冲液中，皱褶假丝酵母脂肪酶在40 °C的半衰期从1.0小时延长至9.2小时。HBA身份对热保护贡献最大，含20%胆碱柠檬酸二氢盐:木糖醇（1:1）的缓冲液将特异腐质霉角质酶在90 °C的半衰期从22分钟延长至62分钟。水含量影响DES组分与蛋白的相互作用和酶水合，进而调节热稳定性。5%乳酸:甜菜碱（2:1）将嗜热毁丝霉漆酶熔点从86.7 °C提高至88.5 °C。含0-90%水的ChCl基DES中，纤维素酶和果胶酶残余活性随水含量增加先升后降。MD模拟显示适量水的加入增加蛋白-溶剂氢键数，降低残基波动，产生更紧凑酶结构。现有AI研究在固定中温下模拟酶在DES介质中的时间依赖性稳定性。分段线性回归模型预测甲酸脱氢酶和NADH半衰期，R²分别为0.738和0.856。多层感知器（multilayer perceptron, MLP）神经网络预测三种脱氢酶失活速率常数，R²为0.893至0.990。但这些研究未将温度作为模型输入，预测的是测试条件下DES配方对酶稳定性的影响而非温度依赖性。

2.3 DES诱导的立体和区域选择性调控

多数上市药物为单一对映体。酶法不对称催化是合成手性药物的最有前景方法之一。DES可调节酶选择性。纯化酮还原酶在ChCl:甘油或ChCl:山梨醇DES-缓冲液混合物中实现>99%转化率和>99%对映体过量（enantiomeric excess, ee）。面包酵母介导的芳基丙酮还原中，从水切换至含水DES混合物可将立体化学结果从S-醇反转至R-醇，两种对映体比例均达98:2。DES还可改变区域选择性，如ChCl:甘油或ChCl:乙二醇将马铃薯环氧化物水解酶StEH1的区域选择性比从缓冲液中的1.35提高至2.33。尽管概念验证研究显示了巨大潜力，DES介导的不对称生物催化在化学和制药制造中实施仍有限。目前尚无成熟QSPR模型预测这些系统中的ee值。DES可能通过改变酶水合、构象系综、活性位点相互作用、底物分配和传质行为，影响竞争立体化学路径的相对速率。根据过渡态理论，立体选择性取决于非对映过渡态之间的吉布斯自由能差，但在DES-酶系统中完全解析这些过渡态仍具挑战。基于“准过渡态”（quasi-transition states, qTS）的机器学习方法可预测不对称催化对映选择性，提取qTS描述符可能为构建DES-酶系统QSPR模型提供起点。

2.4 适用于DES生物催化的极端酶

许多常规酶在高比例DES介质中活性或稳定性降低，部分原因是溶剂化环境和构象动力学改变。DES相关压力与某些极端酶的自然适应特征部分重叠。嗜盐蛋白具有支持高离子条件下功能的表面和溶剂化特征，嗜热酶为高温反应提供稳健支架。海洋极端环境是极端酶发现的重要来源，深海高盐环境回收的酶对高盐、高压和极性溶剂具有耐受性。这种预先存在的稳健性可拓宽可测试的DES组成和水含量范围，减少溶剂侧配方优化负担。例如，嗜热样地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（BLA）在6 M Gly:ChCl（1:1）中比中温同源淀粉酶（BAA）表现出更高活性和稳定性。然而，相同DES条件下极端酶与常规同源酶的系统比较仍稀缺。极端酶还可作为研究DES耐受性的参考表型。近期酶工程研究显示，二级结构过渡区域和MD衍生的残基级水和DES组分分布可指导突变位点选择，MD模拟可解释改进变体相关的结构和溶剂化变化。

3. AI在生物催化DES-酶协同设计中的应用

AI应用可分为两个关联层级：溶剂层面以配方本身为设计对象，预测DES形成、配方级物理化学性质或候选组成；系统层面聚焦特定酶对确定DES环境的响应，预测目标扩展至酶活性、稳定性、选择性或过程性能。

3.1 AI辅助DES设计

当前AI应用处理三项互补任务：判断候选组分能否形成DES、预测指定配方的物理化学性质、提出满足目标性质的候选配方。输入包括MD衍生的氢键数和寿命描述符、编码组分结构和化学计量比的规范SMILES表示。应用算法包括extra trees分类器和基于ELECTRA的Transformer二分类器。QSPR模型可连接配方组成和条件与配方级性质。COSMO-RS衍生的σ-谱描述符编码特定分子间相互作用相关信息，可改善机器学习性质预测。例如，使用COSMO-RS描述符和多元线性回归预测疏水性低共熔溶剂密度和粘度，R²≥0.99。人工神经网络与COSMO-RS描述符结合构建DES粘度QSPR模型。AI辅助DES设计也可从正向预测转向候选生成。扩散和Transformer生成模型提出具有目标DES相关性质的候选组合。

3.2 AI驱动的DES-酶协同设计策略

系统层面预测目标从DES性质变为酶特异性响应。现有研究已开始建立这种映射，如使用PLR模型关联DES物理化学性质和COSMO-RS混合物描述符与甲酸脱氢酶活性和稳定性，开发ANN模型预测脱氢酶失活速率常数，使用COSMO-RS描述符预测漆酶相对活性。这些研究以酶性能而非溶剂性质作为模型输出，但针对固定酶或通过独立酶特异性模型开发，酶身份由数据集隐式表示而非通过蛋白描述符显式表示。跨酶匹配或协同设计需要将酶作为显式输入，以区分酶家族、同源物或工程变体间的差异。酶信息可在多个层级表示：序列特征区分酶身份、进化关系和可能关联DES耐受性的突变模式；结构特征描述溶剂遇到的界面，包括表面电荷和疏水性、溶剂可及区域、表面残基空间分布和活性位点几何。酶特征需与配方和操作变量配对。溶剂侧表示可包括HBA和HBD身份及摩尔比、水含量或水活度、pH、极性、粘度和相互作用描述符。温度、孵育和反应时间、底物载量、辅因子条件和固定化状态定义了活性、稳定性、选择性、转化率或生产率的实验背景。当前AI研究主要进行酶特异性DES筛选或DES-酶匹配。真正的协同设计需将DES配方和酶或其变体均作为可变设计对象，并针对定义的催化和过程终点评估组合。完整实现尚未在DES-酶系统中展示，但这些任务可通过设计-构建-测试-学习循环连接，实验测量更新配方和酶级模型。

4. 当前瓶颈与未来展望

DES-酶系统理性设计面临两个相互关联的瓶颈。第一，DES配方、酶变体、水含量和操作条件的巨大组合空间及其对酶性能的耦合效应，使得单独优化溶剂侧或酶侧均不足。第二，现有DES-酶数据集有限且异质，稀疏覆盖联合设计空间，限制模型可转移性，使端到端协同设计模型的可靠训练和外部验证困难。溶剂侧未来应转向受多目标性质约束的逆向设计。酶侧可适应目标介质，近期研究显示通过修饰蛋白溶剂化和构象特征可提高DES耐受性。未来DES-酶协同设计应将DES配方和酶序列作为耦合设计变量，使用酶特异性催化和过程终点评估组合。极端酶可通过提供可转移适应特征的参考表型做出贡献。HaloMPNN模型通过重新训练ProteinMPNN于“盐入”极端嗜盐蛋白，将非嗜盐蛋白设计为更低预测等电点、更高表面酸性和降低表面及核心疏水性。使用不同类型极端酶数据重新训练的MPNN模型可为DES-酶系统提供与离子环境适应、水合维持或构象稳健性相关的酶侧设计先验。基于Transformer或消息传递神经网络架构的模型可支持DES配方和酶序列的表示学习和候选生成。近期更可行的策略是耦合互补功能模型：DES侧模型提出候选配方，酶侧模型提出序列变体，系统级预测器或多尺度模拟评估配方-酶对。实验测量通过主动学习在设计-构建-测试-学习循环中持续更新各模型，从而在特定反应系统的协同设计工作流中连接DES配方优化和酶工程。

5. 结论

DES通过提供可调微环境调节酶活性、稳定性和选择性，在推进非水相生物催化方面具有巨大潜力。本综述总结了DES在生物催化中的近期应用并考察了AI在DES-酶系统理性设计中的新兴作用。当前计算方法正从预测单一DES性质逐渐转向基于酶级响应的配方筛选。未来进展需要综合考虑DES配方特征和酶物理化学及结构要求的整合策略。通过结合溶剂工程、蛋白质工程和AI驱动建模，DES基生物催化有望迈向更理性和可持续的催化系统。