木质素磺酸钠衍生的LIG-ZnO/Cys生物界面用于完整白色念珠菌细胞的柔性电化学检测

《Bioelectrochemistry》：Sodium lignosulfonate-derived LIG-ZnO/Cys biointerface for flexible electrochemical detection of intact Candida albicans cells

　　

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  木质素磺酸钠可实现生物质来源的LIG-ZnO生物界面。
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  ZnO相关畴区在导电LIG网络中原位形成。
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  半胱胺提供氨基位点以实现ssDNA的稳定固定化。
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  界面阻断效应实现了对完整C. albicans的信号关闭式检测。
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  生物流体中的回收率达到95.3%–103.9%，RSD低于5%。

引言

Candida albicans（白色念珠菌）是最具临床意义的机会性真菌病原体之一，可引起从浅表黏膜念珠菌病到危及生命的侵袭性念珠菌病等多种感染，尤其是在免疫功能低下人群中[1], [2], [3]。念珠菌血症是最常见的真菌性血流感染之一，与高死亡率相关，凸显了对C. albicans进行快速灵敏检测策略的迫切需求[4], [5], [6]。世界卫生组织已将C. albicans列为关键优先真菌病原体，进一步强调了其临床意义和改善诊断技术的紧迫性[7]。

传统的C. albicans鉴定方法，包括微生物培养、生化检测、聚合酶链式反应（PCR）和基于测序的技术，虽然可提供可靠的结果，但通常需要较长的处理时间、经过培训的人员、集中式实验室设施或复杂的样本制备步骤[8], [9], [10]。尽管基于核酸的方法具有较高的特异性和灵敏度，但它们通常涉及DNA提取、扩增或标记步骤，这可能限制其在快速现场筛查和即时检测中的应用[11], [12]。因此，开发一种便携式、低成本且快速的分析平台来直接检测C. albicans细胞非常具有吸引力[13]。

电化学生物传感器因其高灵敏度、快速响应、低成本、微型化潜力以及与便携式设备的兼容性，在病原体检测领域引起了越来越多的关注[14]。通过将生物识别事件或与细胞相关的界面事件转化为可测量的电信号，电化学平台可以提供与目标病原体检测相关的快速定量读数[15], [16]。特别是，阻抗和伏安响应对于生物分子固定化、微生物粘附和细胞诱导的阻断效应所引起的界面变化高度敏感，使其适用于监测传感界面的构建和目标细胞检测[17]。

激光诱导石墨烯（LIG）已成为柔性电化学传感中一种有前途的电极材料[18]。它可以通过对含碳基底或前驱体涂层进行激光辐照来直接成型，形成多孔导电碳网络，而无需复杂的 lithography 或高温处理[19]。LIG的三维多孔形态提供了较大的电活性表面积，有利于电解质渗透，并为表面修饰提供了丰富的位点[20]。这些特性使LIG特别适用于低成本、柔性和微型化的生物传感平台。然而，原始LIG缺乏足够的特异性锚定位点以实现稳定的生物分子固定化，这可能限制其在DNA探针功能化微生物传感中的性能[21]。

为克服这一局限性，金属氧化物功能化提供了一种改善LIG基电极界面性能的有效策略[22]。氧化锌（ZnO）是一种广泛使用的功能纳米材料，因其良好的生物相容性、丰富的表面活性位点和多样的表面化学特性而受到青睐[23]。在LIG基界面中掺入含Zn组分可以增加表面粗糙度并提供额外的位点用于后续化学功能化[24]。在本工作中，采用半胱胺作为含Zn的LIG表面与DNA探针层之间的分子连接剂[25]。其含硫末端可与含Zn的表面物种相互作用，而暴露的氨基则可实现后续通过戊二醛介导的氨基修饰ssDNA探针的固定化。这种界面设计在促进探针固定化的同时保留了LIG基电极的多孔导电结构[26]。

本工作中使用的ssDNA探针改编自先前报道的靶向ITS2区域的C. albicans特异性寡核苷酸序列，并在末端引入了氨基以便在电极表面上进行共价固定化[27]。与依赖于DNA提取和扩增的传统核酸检测不同，本研究将固定化的ssDNA作为DNA功能化电化学界面的一部分，用于对完整C. albicans细胞的直接信号关闭式检测。目标细胞孵育后，细胞相关的界面阻断限制了氧化还原探针的扩散并抑制了界面电子转移，从而产生可测量的电化学响应下降[28]。

先前的LIG基微生物传感器通常依赖于后沉积的功能纳米材料，例如预先合成的Cys-ZnO纳米粒子，在LIG电极形成后引入生物分子锚定位点。尽管有效，但此类后修饰策略通常涉及额外的纳米粒子合成和滴铸步骤，功能界面主要是在电极制造完成后才构建的。

为解决这一问题，我们通过激光诱导含Zn生物质前驱体的碳化，开发了一种木质素磺酸盐衍生的LIG-ZnO/Cys生物界面。在该设计中，木质素磺酸钠被用作可再生碳前驱体，通过直接激光碳化构建生物质来源的多孔LIG骨架。同时，含Zn物种被引入前驱体溶液中，并在激光处理后作为分散的含Zn组分保留下来，在本工作中保守地称为ZnO相关畴区。这种前驱体整合策略不同于传统的后沉积方法，因为生物质来源的碳骨架和含Zn界面组分是在电极形成过程中产生并保留的，而非通过单独的纳米粒子沉积步骤引入。分散的含Zn畴区为后续半胱胺功能化提供了界面位点，从而支持半胱胺介导的探针固定化界面的构建。半胱胺层进一步在电极表面引入氨基，使得氨基修饰的ssDNA探针可以通过戊二醛介导的方式实现固定化。

得益于木质素磺酸盐衍生的多孔LIG骨架、分散的含Zn界面组分以及半胱胺介导的ssDNA固定化策略，所构建的传感界面提高了探针负载位点的可用性和增强了目标细胞相关的界面阻断效应。因此，所提出的生物传感器能够在1.0×10⁰至1.0×10⁶ CFU mL^?1的宽线性范围内灵敏地实现对完整C. albicans细胞的信号关闭式电化学检测，理论检测限为1.01 CFU mL^?1。因此，该界面设计为将柔性生物质来源的LIG电极与ssDNA识别层耦合提供了一条独特且功能化的途径，为真菌细胞的快速检测提供了一个有前景的平台。

章节摘要

材料与试剂

聚乙烯醇（PVA，≥99.5%），木质素磺酸钠（≥99.5%），醋酸锌（≥99.5%），草酸（≥99.0%），乙二醇（≥99.0%），半胱胺（≥99.5%），戊二醛（≥99.5%），铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆，≥99.5%），亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆，≥99.0%），氯化钾（KCl，≥99.0%），无水乙醇（≥99.5%），氯化镁（MgCl₂，≥99.5%），L-半胱氨酸（≥99.5%），谷氨酸钠（≥99.5%），尿素（≥99.5%），雌二醇（≥99.5%），尿酸（UA，≥99.5%），抗坏血酸（AA，≥99.5%），

晶体结构分析（XRD）

采用X射线衍射（XRD）研究了激光处理前后PET支撑前驱体薄膜的结构演变。如图1所示，原始PET、前驱体涂覆PET以及激光处理后的前驱体/PET样品均在约26°处呈现出主要的衍射峰，主要来源于结晶PET基底。基底信号的强贡献归因于PET相对于表面修饰前驱体层的厚度大得多。

在

结论

在本工作中，基于半胱胺修饰的LIG-ZnO界面，开发了一种柔性ssDNA功能化电化学生物传感器用于快速检测C. albicans。LIG-ZnO电极通过在PET支撑的丝网印刷电极上对含Zn木质素磺酸盐基前驱体进行激光诱导碳化而制备。基于XRD、EDS和XPS的综合结果，所掺入的含Zn组分被保守地解释为分散的ZnO相关畴区，而非

CRediT作者贡献声明

Kezhen Fan（樊克震）：撰写——初稿，调查研究，形式化分析，数据整理，概念构思。Jiamu Li（李家木）：可视化。Haoshuo Wang（王浩硕）：可视化。Xianglong Xia（夏翔龙）：调查研究。Chenlin Men（门晨林）：资源获取。Chuanhe Li（李传和）：可视化。Peng Pan（潘鹏）：撰写——审阅与编辑，指导，资源获取，基金获取，形式化分析。Zhengchun Yang（杨正春）：资源获取。Rui Zhang（张瑞）：可视化。Jie He（何杰）：指导。Huayi Li（李华怡）：指导。Chunhong Wang（王春红）：调查研究。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文所报告工作的情况。

致谢

感谢天津市重点研发计划（项目编号：Z20260005，Z20250187）以及技术发展项目（项目编号：H20230015，H20220353，H20220275）的支持。

樊克震|李家木|王浩硕|夏翔龙|门晨林|李传和|潘鹏|杨正春|张瑞|何杰|李华怡|王春红