《Biofilm》：Laboratory and Pilot-Farm Evaluation of Cleaning and Disinfection Protocols for Biofilms in Livestock Drinking-Water Systems
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持续存在的、携带病原体的生物膜会损害畜禽舍内的饮用水水质，导致动物健康问题及产量下降。微生物水质可通过多种处理和/或对饮水系统进行清洁与消毒（C&D）以清除污垢和生物膜来维持。然而，尽管实践中对饮用水水质进行了常规监测，但处理后生物膜的持续存在往往被忽
持续存在的、携带病原体的生物膜会损害畜禽舍内的饮用水水质，导致动物健康问题及产量下降。微生物水质可通过多种处理和/或对饮水系统进行清洁与消毒（C&D）以清除污垢和生物膜来维持。然而，尽管实践中对饮用水水质进行了常规监测，但处理后生物膜的持续存在往往被忽视。本研究评估了饮水系统中常用的（清洁与）消毒方案（过氧化物、过氧乙酸、二氧化氯、甲酸、氯及酶制剂），分别在体外（in vitro）和原位（in situ）条件下进行。研究人员在搅拌式CDC生物膜反应器中，于聚碳酸酯和不锈钢载片上培养了四种选定的三菌种或四菌种群落。原位研究在一个中试肉鸡养殖场中进行，历时四个连续的六周生产周期，在每个周期内同时收集水样和生物膜样本。体外研究表明，消毒剂可减少多物种活菌生物膜细胞，但其效果因微生物组成而异。原位结果显示，清洁与消毒方案几乎未产生效果。因此，以定期监测水质和生物膜存在情况为支撑的靶向干预策略，对于制定处理决策以最小化水污染风险至关重要。
论文解读文章
研究背景与目的
在畜禽养殖环境中，饮用水系统的卫生状况直接关系到动物健康和生产效益。生物膜（biofilm）是由微生物及其分泌的胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）基质组成的结构化三维群落，它能够附着在管道内壁等表面，为病原体提供庇护所，从而成为持续的污染源。尽管养殖户通常会通过添加消毒剂或定期清洁与消毒（cleaning and disinfection，C&D）饮水管线来维持水质，但现有的标准检测方法（如ISO标准）主要针对浮游态（planktonic）微生物，而忽视了生物膜的存在及其顽固性。此外，市售C&D方案的验证大多基于单一菌种生物膜或浮游菌试验，难以反映实际养殖环境中复杂多物种生物膜的耐受性。因此，本研究旨在：（1）在CDC生物膜反应器（CDC Biofilm Reactor?）中表征选定多物种生物膜在聚碳酸酯（polycarbonate，PC）和不锈钢（stainless-steel，SS）两种材料上的发育动力学；（2）比较五种消毒方案对生物膜的杀灭效果；（3）在中试肉鸡场中，通过四个连续生产周期监测六种C&D方案的实际表现，从而弥合实验室研究与现场应用之间的差距。
关键技术方法概述
研究人员从猪保育单元和肉鸡舍饮水系统生物膜样本中分离出8株和4株细菌，并根据前期研究筛选出四种具有协同作用的多物种组合（表1）。体外实验采用CDC Biofilm Reactor?在25℃下培养48小时，分别以PC和SS载片作为附着基质，通过刮取、超声破碎和均质化回收生物膜，随后在非选择性培养基（脑心浸液琼脂，BHI agar）和选择性培养基上进行平板计数，以定量总活菌及各菌种数量。消毒处理时，将附有生物膜的载片浸入五种市售产品（含过氧化氢、过氧化氢+过氧乙酸、过氧化氢+甲酸、二氧化氯、酶制剂+过氧乙酸）中，按推荐浓度和作用时间处理后再行计数。原位试验在同一中试肉鸡场的两栋鸡舍中进行，每栋分为两个隔间、四个栏位，每个栏位有三条饮水线；其中三条分别施加不同的消毒产品（含上述五种及氯气），一条仅做冲洗作为对照。在四个为期六周的生产周期中，于C&D后即刻、生产第2周和第5周采集生物膜拭子和水样，测定22℃和36℃下的总需氧菌数（total aerobic counts，TAC）。
研究结果
3.1 四种多物种组合的生物膜发育动力学
接种后立即测得的附着细胞浓度在SS上为2.9~3.8 log CFU/cm2，在PC上为3.6~4.8 log CFU/cm2。随时间推移，所有组合的活菌生物膜细胞均显著增加（p值见表A2）。24小时后，SS上达到5.1~6.1 log CFU/cm2，PC上达到6.1~6.9 log CFU/cm2；48小时后进一步增至SS上5.7~7.2 log CFU/cm2，PC上5.7~7.8 log CFU/cm2。组合1、2、3在PC上的细胞计数显著高于SS（表A2），而组合4无显著差异（p=0.2196）。物种比例分析显示，Microbacterium paraoxydans在初始阶段（0~4小时）占据优势，但后期被Staphylococcus nepalensis（组合1）、Pseudomonas aeruginosa（组合2）或Citrobacter freundii（组合3）取代；组合4中的三种菌（Acidovorax delafieldii、Brevundimonas diminuta、Pseudoacidovorax intermedius）无法通过选择性培养基区分。
3.2 多物种生物膜的体外消毒效果
对于组合1、2、3，五种消毒产品均使活菌生物膜细胞显著低于未处理对照组（p<0.05）。产品B（过氧化氢+过氧乙酸）、D（二氧化氯）和E（酶制剂+过氧乙酸）实现了至少5 log的减少量，降至定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）；而产品A（过氧化氢）和C（过氧化氢+甲酸）仅降低2~4 log。两种材料（PC与SS）之间无显著差异。组合4对所有产品均高度敏感，处理后无可计数细胞残留。经产品A和C处理后，S. nepalensis在组合1和2中仍占主导，C. freundii在组合3中占优，表明这些物种具有较低的敏感性。
3.3 肉鸡场原位监测结果
在四个生产周期中，对比了C&D组与对照组饮水系统生物膜和水样的TAC。对于自来水系统，产品A在C&D后即刻使22℃孵育的生物膜细胞计数显著低于对照（p=0.0147），产品D在第5周使36℃孵育的计数显著降低（p=0.0431）。在水样方面，产品A和E在C&D后即刻显著降低了两种温度下的TAC（p分别为0.0447、0.0157和0.0192、0.0257），产品C和F在生产第2周显著降低了36℃下的TAC（p=0.0360、0.0339）。然而，对于雨水系统，未观察到任何产品与对照之间存在显著差异。总体而言，原位条件下C&D方案对生物膜的去除效果甚微。
讨论与结论
本研究的讨论指出，目前缺乏针对生物膜消毒效果的标准化实验室测试，而现有ISO标准主要关注浮游菌，无法反映多物种生物膜的复杂性。体外实验中，含S. nepalensis和C. freundii的组合表现出更强的抵抗力，而源自肉鸡舍的组合4则完全敏感，表明消毒效果高度依赖于微生物群落组成。原位试验中，即使体外有效的产品（如B、D、E）在现场也未展现出持续效果，这归因于环境因素（温度波动、水质变化、管道材质、抗生素使用等）以及生物膜群落的高度多样性和空间异质性。酶制剂预处理结合过氧乙酸消毒的方案在两种场景下均表现良好，显示出实际应用潜力。
研究结论：控制畜禽饮水系统中的持续性生物膜仍是维持高微生物水质的重大挑战。尽管有多种C&D策略可用，但它们大多侧重于清洁管道而非靶向生物膜。本研究中，两种过氧化氢基产品在体外对含有协同物种（C. freundii和S. nepalensis）的多物种生物膜效果不佳，而其他三种消毒剂（过氧化氢+过氧乙酸、二氧化氯、酶制剂+过氧乙酸）则彻底清除了所有生物膜细胞。然而，这五种消毒剂能完全清除不含上述关键物种的肉鸡舍多物种组合，凸显了耐药性对微生物组成的依赖性。在肉鸡中试农场中，最高剂量的过氧化氢减少了活菌生物膜细胞；但体外有效的消毒剂在原位并未表现出同样效果，表明环境因素和物种相互作用的影响难以在实验室中复现。综合来看，这些发现强调了需要开发面向生物膜的消毒策略、对水源和使用点进行常规水质监测，并系统评估饮水管线中的生物膜存在情况，以便及时采取有效干预措施。
