营养感知蛋白酶DegS通过CdgH–c-di-GMP–VpsR轴在营养限制条件下抑制霍乱弧菌生物被膜形成

《Biofilm》：A nutrient-sensing protease DegS suppresses biofilm formation in Vibrio cholerae via the CdgH–c-di-GMP–VpsR axis under nutrient limitation

　　

霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）是引起霍乱的病原体，该疾病以严重急性分泌性腹泻为特征，表现为快速体液丧失，可导致严重脱水甚至死亡。霍乱弧菌的传播遵循明确的粪-口途径，其生命周期在两种截然不同的环境之间剧烈交替：营养丰富的人体小肠腔和贫营养的水生环境。摄入受污染的水后，该细菌定植于肠道上皮，导致产生大量特征性的“米泔水”样粪便，将大量细菌释放回环境中。这种排出过程提出了一个关键的生理挑战：细菌必须从营养充足的宿主环境快速适应到营养贫乏的水生状态，以等待新的感染机会。

在这些严酷的环境生态位中，形成结构化的表面相关群落（即生物被膜）是一种核心生存策略。生物被膜赋予细菌增强的抵抗多种胁迫的能力，包括渗透波动、捕食和抗生素，从而作为持久的 environmental 储库，确保细菌在暴发间期的持续存在，并促进地理传播。相反，在宿主体内，生物被膜样聚集体已被证明能显著增强肠道定植，并通过物理屏障效应提供抵抗宿主免疫清除的保护。因此，生物被膜形成在霍乱弧菌传播周期的两个关键阶段——高效宿主定植和长期环境生存中均发挥不可或缺的作用。

霍乱弧菌生物被膜的形成与消散受到复杂网络动态调控，该网络整合第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）、群体感应系统和关键转录调控因子（如VpsR和VpsT），协调运动型与固着型生活方式之间的转换。从宿主到环境的转变伴随剧烈的营养下降，细菌感知并响应特定营养线索以调节生物被膜行为。例如，碳可利用性通过磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统（PTS）影响生物被膜形成；磷酸盐限制通过PhoBR双组分系统调控生物被膜基因表达；铁可利用性通过Fur蛋白和小RNA RyhB调节c-di-GMP代谢及基质产生。

然而，尽管下游整合机制逐渐被阐明，一个更基本的问题仍未解决：当霍乱弧菌从宿主转入贫营养水生环境时，哪一类上游感知元件首先检测到环境营养水平的全面且根本性下降？此外，这一关键的生存胁迫信号如何随后被转导和传递，以产生启动生物被膜发育程序的精确指令？这些初级感知和信号转导元件的身份及运行逻辑构成了理解霍乱弧菌环境适应周期的核心空白。解析这一初始检测步骤对于完整理解其环境持久性以及制定靶向干预策略至关重要。

周质丝氨酸蛋白酶DegS是σE（rpoE）胁迫响应通路的关键调控因子。已有研究表明，在霍乱弧菌中，DegS参与调控多种生理过程，包括运动性、氧化胁迫响应和能量代谢。然而，其调节生物被膜形成等群体行为的潜在作用尚未被探索。在本研究中，研究人员将DegS确定为低营养条件下生物被膜发育的关键抑制性调控因子。研究发现，ΔdegS突变体表现出显著增强的生物被膜形成能力、增加的抗生素耐受性，以及在微塑料等环境相关表面上显著提高的定植能力。在机制上，研究阐明了一条先前未被识别的信号轴：DegS独立于经典σE通路，负调控二鸟苷酸环化酶CdgH。这种抑制导致细胞内c-di-GMP水平升高，进而激活转录调控因子VpsR并上调生物被膜基质基因的表达。该DegS–CdgH–c-di-GMP–VpsR信号通路不仅限定的最小培养基中发挥功能，在模拟自然水生环境中同样有效，强调了其生态相关性。研究结果揭示了一个新的调控回路，将周质蛋白酶与c-di-GMP依赖性转录控制功能性连接，为霍乱弧菌环境适应的分子基础提供了新见解，并指出了其传播链中的潜在干预靶点。

**论文解读：营养感知蛋白酶DegS通过CdgH–c-di-GMP–VpsR轴抑制霍乱弧菌生物被膜形成**

**一、研究背景与科学问题**

霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）是霍乱的病原体，其传播依赖于在营养丰富的人体小肠与贫营养水生环境之间的生命周期转换。生物被膜是霍乱弧菌在寡营养环境中存活的关键策略，可增强细菌对渗透胁迫、捕食和抗生素的抵抗力，并促进环境传播。生物被膜的形成受第二信使c-di-GMP、群体感应及转录调控因子VpsR/VpsT等网络调控。已有研究发现碳、磷酸盐、铁等特定营养信号可通过不同通路影响生物被膜，但一个根本问题悬而未决：当细菌从宿主转入贫营养水体时，哪类上游感知元件首先检测到整体营养水平的下降，并将该胁迫信号转导至下游生物被膜调控网络？DegS作为周质丝氨酸蛋白酶，已知是σE胁迫响应通路的关键调控因子，并参与霍乱弧菌运动性、氧化胁迫应答和能量代谢，但其是否调控生物被膜形成尚不清楚。本研究旨在解析DegS在营养限制条件下对霍乱弧菌生物被膜形成的调控作用及分子机制。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员以非O1/non-O139霍乱弧菌HN375为野生型菌株，构建了ΔdegS突变体及多种双突变体和回补菌株。研究发现，degS转录在低营养（M9）条件下显著上调，且随营养浓度降低而升高，表明DegS是营养响应性调控因子。在M9培养基中，ΔdegS突变体生物被膜形成量较野生型显著增加，扫描电镜和共聚焦显微镜显示其形成致密、结构复杂且富含胞外聚合物的三维生物被膜，而回补degS可恢复野生型表型。在LB富营养条件下，ΔdegS与野生型无差异，表明DegS的抑制功能具有营养限制特异性。ΔdegS突变体生物被膜对抗生素（阿奇霉素、红霉素、多西环素、四环素、环丙沙星）的耐受性显著增强，且在聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）、低密度聚乙烯（LDPE）、高密度聚乙烯（HDPE）、聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）五种微塑料表面的定植能力显著提高，其中PP表面定植增加271倍。

机制研究表明，ΔdegS突变体中rpoE转录水平在M9条件下反而显著上调，但ΔdegSΔrpoE双突变体仍表现与ΔdegS相同的增强生物被膜表型，证明DegS抑制生物被膜不依赖经典σE通路。通过检测8个生物被膜基质相关基因（vpsA、vpsL、vpsU、vpsT、vpsR、bap1、rbmA、rbmC）的转录水平，发现M9条件下ΔdegS中这些基因均显著上调；构建ΔdegSΔvpsR、ΔdegSΔvpsU和ΔdegSΔvpsT双突变体后，仅ΔdegSΔvpsR将生物被膜恢复至野生型水平。Western blot证实ΔdegS中VpsR蛋白水平显著升高，回补后恢复。利用Bc3-5生物传感器检测发现ΔdegS中c-di-GMP水平显著升高。对13个c-di-GMP代谢酶基因进行转录分析，并在ΔdegS背景中逐一敲除9个候选正调控基因，仅ΔdegSΔcdgH双突变体完全恢复至野生型生物被膜水平；回补cdgH可恢复增强表型。Western blot显示ΔdegS中CdgH蛋白水平升高。在ΔdegSΔcdgH双突变体中，vpsR转录和c-di-GMP水平均恢复至野生型水平，而ΔdegSΔvpsR中c-di-GMP仍保持高水平，证明CdgH作用于VpsR上游。在人工海水和天然湖水模拟环境中，ΔdegS突变体生物被膜形成均显著高于野生型，且ΔdegSΔvpsR和ΔdegSΔcdgH双突变体均消除增强表型，证明该调控通路在自然水生环境中功能保守。

**三、关键技术方法**

研究使用了以下核心技术：（1）基因敲除与回补：利用自杀质粒pWM91构建基因缺失突变体，通过pBAD24载体构建回补菌株；（2）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因转录水平；（3）Western blot检测VpsR和CdgH蛋白水平；（4）结晶紫染色定量生物被膜形成量；（5）扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析生物被膜三维结构；（6）基于Bc3-5生物传感器的c-di-GMP荧光报告系统测定胞内c-di-GMP浓度；（7）微塑料表面定植实验及抗生素杀死实验评估生态表型。天然湖水采集自遵义医科大学新蒲校区湿地公园人工湖（27°43'22.81"N，107°4'6.77"E）。

**四、结果分述**

3.1 DegS在低营养条件下抑制霍乱弧菌生物被膜形成：qRT-PCR显示degS转录在M9中上调，且在梯度稀释M9（0.5×、1×、2×）中随营养浓度升高而递减。LB中WT与ΔdegS生物被膜无差异，M9中ΔdegS显著增强，回补恢复。生长曲线证明三菌株均在约20 h进入稳定期，排除生长相差异。SEM和CLSM证实ΔdegS形成致密富EPS的3D结构。

3.2 ΔdegS增强生物被膜促进环境适应：抗生素杀伤实验显示ΔdegS在五种抗生素处理下存活率显著高于WT，且该耐受性依赖vpsR，ΔdegSΔvpsR双突变体存活率与WT一致。微塑料共培养实验中ΔdegS在PET、LDPE、HDPE、PP、PS上的定植量均显著高于WT，PP上提高271倍。

3.3 ΔdegS增强生物被膜不依赖rpoE通路：LB中ΔdegS的rpoE转录降低，M9中反而升高；ΔdegSΔrpoE双突变体生物被膜表型与ΔdegS单突变体无差异，证明DegS的作用独立于σE通路。

3.4 DegS对生物被膜的调控依赖VpsR：M9条件下ΔdegS中vpsA、vpsL、vpsU、vpsT、vpsR、bap1、rbmA、rbmC均上调。ΔdegSΔvpsR恢复生物被膜至WT水平，而ΔdegSΔvpsU和ΔdegSΔvpsT仍增强。Western blot证实ΔdegS中VpsR蛋白积累增加。CLSM确认ΔdegSΔvpsR结构稀疏，回补vpsR重建复杂结构。

3.5 DegS通过CdgH–c-di-GMP–VpsR通路调控生物被膜：Bc3-5传感器检测显示ΔdegS中c-di-GMP显著升高。ΔdegSΔcdgH完全恢复生物被膜至WT水平，回补cdgH恢复增强表型。Western blot显示ΔdegS中CdgH蛋白升高。ΔdegSΔcdgH中vpsR转录和c-di-GMP恢复正常，而ΔdegSΔvpsR中c-di-GMP仍高，证明CdgH作用于VpsR上游。

3.6 DegS–CdgH–c-di-GMP–VpsR通路在自然水生环境中功能保守：人工海水和天然湖水中ΔdegS生物被膜均显著高于WT，ΔdegSΔvpsR和ΔdegSΔcdgH均恢复至WT水平，回补相应基因恢复增强表型。

**五、讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，DegS是周质丝氨酸蛋白酶，经典功能是激活σE包膜应激响应。在霍乱弧菌从宿主肠道转入贫营养水体时，营养下降可能引发外膜蛋白错误折叠，激活DegS。然而在低营养胁迫下，DegS抑制生物被膜的作用不依赖σE通路，而是通过新型DegS–CdgH–c-di-GMP–VpsR轴实现。该通路作为环境调节的“变阻器”，精细调控浮游与固着生活方式转换，避免过早固着导致种群困于不良生态位。DegS缺失则导致过度生物被膜状态，增强抗生素耐受和微塑料定植，提示其环境传播风险。讨论还提出DegS与CdgH之间直接分子连接尚不明确，以及DegS感知营养缺乏的具体信号（如OMP错误折叠、周质渗透压变化）有待阐明，未来需将该通路与PhoBR、Fur/RyhB等其他营养感知网络整合。

研究结论：营养限制诱导的周质胁迫激活DegS后，其不仅通过σE通路修复包膜，还独立地通过CdgH–c-di-GMP–VpsR级联抑制生物被膜形成。该通路作为环境调谐的调节器，影响抗生素耐受性和微塑料等水生界面定植，为理解霍乱弧菌环境持久性和传播机制提供了新分子见解，并提示DegS可作为破坏霍乱环境储库的干预靶点。