一种兼具神经营养和免疫调节双重功能的猪源无细胞神经基质膜通过协调雪旺细胞激活与再髓鞘化加速周围神经再生

《Biomaterials Advances》：A porcine acellular nerve matrix membrane with dual neurotrophic and immunomodulatory functions accelerates peripheral nerve regeneration by coordinating Schwann cell activation and remyelination

　　

•SNCM保留了关键神经细胞外基质成分，并表现出优异的材料特性和免疫调节性能。
•SNCM在体外促进了神经元分化并增强了雪旺细胞的功能。
•在兔神经损伤模型中，SNCM防止了手术并发症并促进了功能恢复。
•SNCM通过微环境调节促进神经修复，实现了完全有髓纤维再生。

**1. 引言**

周围神经损伤构成了重大的全球性临床负担。仅在美国，周围神经损伤就影响了约3%的所有创伤患者，并导致估计每年1500亿美元的医疗支出[1]。此类损伤会导致严重的感觉和运动功能障碍、慢性神经病理性疼痛，并对患者和医疗系统造成沉重的社会经济负担[2]、[3]。尽管周围神经系统具有内在的再生能力，但严重损伤后的功能恢复往往不尽人意[4]。关键的是，尽管经过数十年的大量研究，目前仍没有FDA批准的治疗策略被证明能增强人类的功能恢复[1]。这主要是由于损伤后微环境恶劣，以持续性慢性炎症、过量氧化应激、神经营养支持不足以及纤维性瘢痕组织的形成为特征，后者在物理上阻碍了轴突再生[5]、[6]。值得注意的是，最新证据表明，该微环境中过量的氧化应激可触发雪旺细胞焦亡，这是一种由线粒体活性氧积累和NLRP3炎症小体激活驱动的编程性炎症细胞死亡。该焦亡过程随后释放IL-1β和IL-18，最终损害神经元功能并延迟神经再生[7]、[8]。这些病理因素共同破坏了成功神经修复所必需的高度协调的细胞级联反应，该级联反应涉及Wallerian变性、雪旺细胞激活与去分化、Büngner带的形成、定向轴突延伸，以及最终的再髓鞘化和靶器官再神经支配[9]、[10]。鉴于这些复杂性，目前的临床策略已被证明不足以应对神经再生的多方面挑战[3]、[11]。

当前治疗周围神经损伤的临床策略面临相当大的局限性[12]。自体神经移植仍然是桥接神经缺口的金标准，特别是对于那些无法直接修复的长段缺损[13]。该技术利用患者自身的神经，通常取自感觉供区，为再生的轴突提供天然的表膜、神经束膜和神经内膜结构引导[14]、[15]。然而，这种方法存在多个固有的缺点，包括供区并发症、有限的组织可用性、供体与受体神经之间的管径不匹配，以及与第二手术部位相关的额外创伤[16]、[17]。对于适合无张力端端神经吻合术的情况，即断裂的神经末端可以直接吻合，可以避免供区并发症。然而，由于缺乏对再生微环境的主动调控，这种方法往往无法防止术后并发症，如神经周围粘连、创伤性神经瘤形成和轴突芽生的无序[18]、[19]。

为了克服这些局限性，已经开发了各种合成和天然聚合物基神经导管作为自体移植物的替代品[20]、[21]。包括聚（乳酸-乙醇酸）、壳聚糖和胶原蛋白在内的材料具有生物相容性和可调节的降解性[22]。组织工程的最新进展引入了具有定制机械、化学和导电信号的生物材料支架，以主动调节宿主反应，超越了被动的桥接[23]。例如，导电纳米材料与生物活性表面涂层（如聚多巴胺）以及拓扑引导信号的整合已被证明可以提供协同效应，极大地增强雪旺细胞迁移、轴突生长和髓鞘形成[24]。然而，大多数传统导管仅作为被动的物理桥，为轴突生长提供空间，但缺乏动态调节再生龛所需的生物化学复杂性[25]；它们缺乏神经特异性细胞外基质成分、神经营养因子和免疫调节能力[26]、[27]。因此，其临床疗效，特别是对于长段或复杂神经损伤，仍然有限。理想的支架必须超越被动支持，不仅需要合适的生物力学性能和可控降解，还需要能够重现天然神经微环境的能力[28]、[29]。

源自天然组织的脱细胞细胞外基质支架提供了一种有前景的策略，可以在保留固有生物活性的同时最大限度地减少免疫原性[30]。通过物理、化学或酶学方法去除细胞抗原，脱细胞基质保留了天然细胞外基质的结构完整性和功能性分子[16]、[31]。然而，组织来源至关重要；来自非神经来源如真皮或小肠黏膜下层的脱细胞基质缺乏神经组织的独特组成特征，可能会限制其在支持神经特异性再生事件中的疗效[32]、[33]。相比之下，神经来源的脱细胞基质固有地保留了一系列复杂的神经特异性成分，包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白、硫酸化糖胺聚糖以及内源性神经营养因子，如神经生长因子和脑源性神经营养因子[15]、[34]、[35]。这些成分协同作用，促进雪旺细胞激活，为再生的轴突提供接触引导，并创造允许功能性再神经支配的环境。

基于这一原理，我们通过温和的脱细胞工艺结合溶液浇铸法开发了猪坐骨神经来源的无细胞基质膜（SNCM），旨在最大限度地保留天然神经细胞外基质的组成和生物活性（方案1）。制备了猪皮肤来源的无细胞基质膜（SDCM）作为非神经对照，以验证神经组织来源的优势。我们系统地表征了物理化学性质，包括形态、元素组成、力学性能、降解行为、亲水性和血液相容性。我们进一步评估了两种材料在引导雪旺细胞行为、神经元分化和细胞迁移方面的免疫调节活性、细胞相容性和生物学性能。最终使用兔胫神经损伤模型评估了体内修复疗效，通过全面分析吻合口周围粘连、神经瘤形成、功能恢复和组织学再生。本工作表明，一种神经特异性脱细胞基质支架可以主动协调雪旺细胞介导的修复、轴突引导和再髓鞘化，提出了一种可转化的先进周围神经重建策略。

下载：下载高分辨率图片（464KB）| 下载：下载全尺寸图片

方案1. SNCM制备和功能评估的示意图。（a）制备。猪坐骨神经经过处理（脱污染→酶处理→冷冻干燥）生成SNCM，保留了关键ECM成分（GAGs、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、NGF）。（b）表征。SNCM表现出良好的延展性、可生物降解性、血液相容性和细胞相容性。它降低了ROS，促进了M1到M2的免疫调节，诱导了PC12细胞的神经发生，并激活了雪旺细胞（S100）。（c）体内修复。在兔胫神经损伤模型中，SNCM在早期、中期和晚期促进了轴突生长、雪旺细胞排列和髓鞘形成，实现了功能性神经再生。缩写：ECM，细胞外基质；GAGs，糖胺聚糖；NGF，神经生长因子；ROS，活性氧；SC，雪旺细胞。

**2. 材料**

新鲜猪坐骨神经和猪皮从当地市场获得的杂交猪中获取，符合ISO 22442-2标准。胰蛋白酶溶液和Triton X-100溶液购自Solarbio（中国）。CaCl?、KCl、Na?HPO?和KH?PO?购自Macklin（上海，中国）。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）、L929细胞、未分化的PC12细胞、分化的PC12细胞和雪旺细胞购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

**2.1 猪坐骨神经来源复合膜（SNCM）的制备**

SNCM制备如下。分离新鲜猪坐骨神经，去除表膜和结缔组织，用PBS冲洗，切成3-5 mm的段，再次冲洗，并在PBS中浸泡30分钟以去除血液。将各段在0.25%胰蛋白酶中振荡孵育6-8小时，用去离子水洗涤，然后用3% Triton X-100振荡处理24小时。充分洗涤后，将样品冷冻干燥以获得无细胞神经基质。将干燥的基质研磨，溶解在1%醋酸中振荡24小时，浇铸到板上，并在室温下干燥形成膜。将膜用PBS冲洗至中性pH，风干并储存。

猪皮肤真皮来源复合膜（SDCM）按相同方法制备作为对照，使用去除脂肪、筋膜和毛发后的新鲜猪皮（0.5 cm × 0.5 cm的块）作为起始材料。

脱细胞效率的验证。为验证脱细胞过程的效率，定量了无细胞基质中残留的DNA含量。将SDCM和SNCM样品（每个5-10 mg干重）在56°C下用蛋白酶K过夜消化。使用商业DNA定量试剂盒定量消化产物中的总DNA含量，残留DNA量以每毫克干组织纳克DNA计算。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析残留DNA片段的分子量分布，以新鲜猪坐骨神经和新鲜猪真皮作为阳性对照。对于组织学验证，脱细胞前后的组织样品经固定、包埋、切片，并用苏木精-伊红（H&E）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。所有染色切片均在荧光显微镜下观察。

**2.2 SNCM成分的定量**

胶原蛋白含量通过测定羟脯氨酸来确定，羟脯氨酸是胶原蛋白中一种特异且稳定的氨基酸。羟脯氨酸被氯胺-T氧化形成发色团，并在570 nm处测量吸光度[36]。总胶原蛋白含量通过将测得的羟脯氨酸含量乘以转换系数7.46来计算。

层粘连蛋白、纤维连接蛋白、糖胺聚糖和神经生长因子（NGF）的含量使用商业ELISA试剂盒定量[37]。按照制造商的说明进行测定，在450 nm处测量吸光度。通过标准曲线计算浓度。

**2.2.1 酸溶解后NGF和糖胺聚糖（GAG）的保留**

为评估酸溶解步骤是否影响ECM成分的完整性，在醋酸处理前后对NGF和GAG含量进行了定量。将新鲜制备的SNCM分为两份：一份作为未处理对照，另一份溶解在1%醋酸中（每克SNCM 10 mL）在4°C下24小时，然后中和至pH 7.4。使用商业ELISA试剂盒测量NGF和GAG浓度。保留率以酸处理后相对于未处理对照的剩余百分比计算。

**2.3 物理化学表征**

**2.3.1 结构表征**

在Bio-Rad Win-IR光谱仪上记录傅里叶变换红外（FT-IR）光谱，范围为4000-500 cm?1，光谱分辨率为4 cm?1。

**2.3.2 形态分析**

使用扫描电子显微镜（SEM，EVO LS15，ZEISS，德国）表征SNCM和SDCM的形态和元素组成。采用能量色散X射线光谱法（EDX）对碳（C）、氧（O）、氮（N）、磷（P）、硫（S）和钙（Ca）进行元素映射。

**2.3.3 体外降解试验**

Sorensen缓冲液（pH 7.4）通过将1.7 g磷酸二氢钾、7.7 g无水磷酸氢二钠和0.06 g无水氯化钙溶解在1000 mL纯化水中制备。I型胶原酶溶液（1 U/mL）通过将0.9 mg I型胶原酶溶解在202 mL预热至37°C的Sorensen缓冲液中制备。将干燥并预称重的样品（m?）分别放入含有1 mL预热胶原酶溶液的离心管中，并在37°C下孵育。在预定时间点，取出三个样品，用去离子水冲洗，干燥至恒重（m?），并计算失重比。

**2.3.4 热性能**

使用Mettler Toledo TGA/DSC3+仪器同时进行热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）。SDCM和SNCM样品（约5-10 mg）均在氮气气氛下（流速10 mL/min）以10°C/min的升温速率从30°C加热至800°C。从DSC曲线确定玻璃化转变温度（Tg）和熔点（Tm），从TGA热图确定分解温度（Td）和10%失重温度（T90%）。

**2.3.5 力学性能**

使用万能试验机（CMT8502，MTS Systems Co., Ltd.，美国）对SNCM和SDCM进行拉伸测试。从应力-应变曲线确定抗拉强度、拉伸力、弹性模量和断裂伸长率[38]。

**2.3.6 溶胀性能**

在pH 4.5、7.4和8.0的PBS溶液中通过重量法评估SNCM和SDCM的溶胀行为。将冷冻干燥样品（初始质量W?）浸入PBS中，在指定时间点（1-12 h）取出。用滤纸仔细吸去表面水分后，记录溶胀质量（W?），直至达到溶胀平衡。溶胀率（%）计算为[(W? - W?) / W?] × 100%。

**2.3.7 保水性**

将样品切成1 cm × 1 cm的块并称量（M?），浸入PBS（pH 7.4）中直至达到溶胀平衡。平衡后，将样品悬挂30秒，用滤纸吸去表面水，记录质量（M?，平衡质量）。然后将样品在2000 rpm下离心10分钟，记录质量（M?）。保水率计算为(M? / M?) × 100%。

**2.3.8 润湿性测试**

使用SZ-CAMD33分析仪（上海，中国）通过 sessile drop法测量静态水接触角来表征SNCM和SDCM的润湿性[39]、[40]。

**2.3.9 体外血液相容性测试**

**2.3.9.1.**

体外溶血试验
样品在37 °C的生理盐水中提取72 h（6 cm2/mL）。新鲜抗凝小鼠全血以2000 g离心5 min，弃去上清液和白细胞层。红细胞用生理盐水洗涤三次，直至上清液澄清，再重悬至4%（v/v）。然后，将2 mL红细胞悬液与2 mL样品提取物（试验组）、生理盐水（阴性对照）和0.1% Triton X-100（阳性对照）混合。在37 °C孵育60 min后，将混合物以2000 rpm离心5 min。以阴性对照为空白，在540 nm处测量上清液的吸光度。溶血率计算公式为：(OD? ? OD?) / (OD? ? OD?) × 100% [41]。

2.3.9.2. 血液凝固试验
灭菌后的样品在37 °C预孵育15 min。将新鲜小鼠血液（200 μL）置于每个样品上，与20 μL 0.01 M CaCl?混合，静置孵育5 min。加入2 mL去离子水后成像，将体积调至25 mL，在40 rpm、37 °C下振荡5 min。取200 μL移液至96孔板中，在540 nm处测量吸光度。血液凝固指数（BCI）计算公式为：BCI = (OD? ? OD?) / (OD? ? OD?) × 100%，其中OD?、OD?和OD?分别为样品、阳性对照（新鲜全血）和阴性对照（PBS抗凝血液）的吸光度 [42]。

2.4. 体外生物学评估与表征
2.4.1. 体外试验样品提取物的制备
对于所有体外生物学评估，均采用样品提取物（条件培养基）而非直接在膜上接种细胞，以特异性评估基质释放的可溶性生化信号的生物活性。简言之，将无菌SNCM和SDCM膜切成小块，按每6 cm2膜对应1 mL培养基的比例，在高糖DMEM（补充10% FBS和1%青霉素-链霉素）中于37 °C孵育24 h。孵育后，通过0.22 μm无菌滤器过滤收集所得提取物以去除碎片，立即使用或于4 °C储存用于后续实验。

2.4.2. RAW 264.7巨噬细胞培养与处理
RAW 264.7巨噬细胞在高糖DMEM（HyClone）中培养，培养基补充10% FBS（Newzerum）和1%青霉素-链霉素（Gibco），常规以1:5比例传代。

一氧化氮（NO）检测：将细胞以2 × 10?个/孔接种于96孔板中。24 h后，用含LPS（1 μg/mL）的SNCM或SDCM提取物替换培养基，再孵育24 h。将上清液（100 μL）与等体积Griess试剂（5% H?PO?中的0.2% NED和2%磺胺）混合，在540 nm处测量吸光度。NO水平以未处理对照为基准表示。

活性氧（ROS）分析：将细胞接种于6孔板中。24 h后，用含LPS的样品提取物处理24 h。使用DCFH-DA探针（Biosharp）通过流式细胞术检测细胞内ROS水平，并用荧光显微镜观察 [43]。

巨噬细胞极化分析：通过流式细胞术分析M1（CD86）和M2（CD206）标志物。将细胞以6.5 × 10?个/孔接种于6孔板中24 h，然后用支架提取物和LPS（1 μg/mL）处理CD86，或用LPS和ATP处理CD206，再处理24 h。收集细胞，用抗CD86（YA0512, Immunoway）和抗CD206（AK22830, Elabscience）染色，随后加入二抗（Goat Anti-Human IgG Fc, RS2304, Immunoway）。通过流式细胞术分析样品。

2.4.3. 体外细胞相容性
使用在高糖DMEM（补充10% FBS和1%青霉素-链霉素）中培养的L929成纤维细胞评估SNCM和SDCM的细胞相容性。评估内容包括基于MTT的细胞毒性（使用24 h提取物）和活/死染色细胞粘附。

将L929细胞以1 × 10?个/孔接种于96孔板中，培养24 h，然后用制备的样品提取物替换培养基，培养22 h。随后，向每孔加入50 μL MTT溶液，孵育2 h。去除培养基，加入100 μL异丙醇。振荡后，使用Tecan Infinite M200酶标仪在570 nm处测量吸光度。细胞活力计算公式为：细胞活力（%）= (ODs / ODb) × 100%，其中ODs和ODb分别为样品组和空白对照组的吸光度值。

活/死细胞染色：对数生长期的L929细胞以8 × 103个/孔接种于96孔板中，孵育24 h。然后用制备的样品提取物替换培养基，再孵育24 h。用PBS洗涤细胞两次，每次5 min，在37 °C避光条件下用100 μL Calcein-AM/PI工作液染色30 min，用荧光显微镜观察。使用ImageJ计数活细胞和死细胞，细胞活力计算公式为（活细胞数/总细胞数）× 100%。

2.4.4. 未分化PC12细胞的增殖与分化
增殖检测：将对数生长期的未分化PC12细胞用PBS洗涤，胰蛋白酶消化，重悬至2 × 10?个/mL。将细胞悬液（100 μL，2000个细胞）与样品提取物在96孔板中混合；空白对照组加入DMEM。轻摇后孵育1、3、5和7天。在每个时间点加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，在450 nm处测量吸光度。

分化检测：将未分化PC12细胞胰蛋白酶消化，重悬至5 × 10?个/mL，接种于6孔板中（2 mL/孔）。24 h孵育后，用样品提取物替换培养基，培养至多7天。在第1、3、5和7天，用倒置显微镜观察细胞形态。每孔拍摄5个随机视野，将具有≥一个细胞直径神经突的细胞计为分化细胞。分化率计算公式为（分化细胞数/总细胞数）× 100%。

2.4.5. 分化PC12细胞的迁移、增殖与细胞骨架染色
Transwell迁移检测：将收获的对数生长期分化PC12细胞在无血清培养基中重悬至1 × 10?个/mL。将Transwell小室（8 μm孔径）放入24孔板中，用500 μL无菌PBS激活10 min。对于趋化试验，在下室加入600 μL含10% FBS的培养基（对照）或含10% FBS和样品提取物的培养基（实验组）。放置小室后，在每孔上室加入200 μL细胞悬液。24 h孵育后，取出小室，擦除上膜表面的细胞。用4%多聚甲醛固定下表面的迁移细胞15 min，用0.1%结晶紫染色15 min，在200倍放大倍数下使用ImageJ软件在每孔5个随机视野中计数。

划痕愈合检测：将分化PC12细胞以1 × 10?个/孔接种于6孔板中，培养至90%汇合。用1 mL样品提取物（实验组）或新鲜培养基（对照组）替换培养基，预孵育24 h。用无菌100 μL枪头在每孔划三条平行划痕。补充相应培养基后，标记参考点，在0、6和24 h拍摄图像。使用ImageJ测量划痕面积，迁移率计算公式为（面积?? ? 面积??）/ 面积?? × 100%。

增殖检测：将分化PC12细胞重悬至2 × 10?个/mL（2000个/100 μL），与样品提取物或MEM培养基（空白对照）一起接种于96孔板中，孵育1、3、5和7天。在每个时间点加入10 μL CCK-8，孵育3 h，在450 nm处测量吸光度。

细胞骨架染色：将分化PC12细胞接种于12孔板中的无菌盖玻片上，培养至70%汇合。用样品提取物（实验组）或新鲜培养基（对照组）替换培养基24 h。用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1% Triton X-100通透10 min，用1% BSA封闭30 min。然后在避光条件下用100 nmol/L荧光鬼灯素孵育1 h，继用1 μg/mL DAPI孵育5 min。用抗褪色封片剂封盖盖玻片，用荧光显微镜成像。

2.4.6. 施旺细胞的迁移、增殖与免疫荧光染色
施旺细胞的Transwell迁移检测按2.5.4节PC12细胞所述方法执行。施旺细胞用无血清培养基冲洗两次以去除残留血清，重悬至1 × 10?个/mL，后续步骤与PC12细胞相同。

施旺细胞的划痕愈合检测按2.5.4节PC12细胞所述方法执行。将施旺细胞以1 × 10?个/孔接种于6孔板中，培养至90%汇合，后续样品处理、划痕制作、成像和数据分析程序相同。

增殖检测：将施旺细胞重悬至2 × 10?个/mL，与样品提取物或MEM培养基（空白对照）一起接种于96孔板中，孵育1、3、5和7天。在每个时间点加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

细胞骨架（F-actin）鬼灯素染色：将施旺细胞接种于12孔板中的无菌盖玻片上，培养至70%汇合。用样品提取物（实验组）或新鲜培养基（对照组）替换培养基24 h。然后用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1% Triton X-100通透10 min，用1% BSA封闭30 min。在避光条件下用100 nmol/L荧光鬼灯素孵育1 h，继用1 μg/mL DAPI孵育5 min。用抗褪色封片剂封盖盖玻片，用荧光显微镜成像。

S100免疫荧光染色：施旺细胞按上述方法接种和培养。用4%多聚甲醛在4 °C固定细胞12 h，用PBS洗涤三次，用0.25% Triton X-100通透10 min，在室温下用5% BSA封闭30 min。在4 °C用抗S100一抗（Anti-S100, ab204028, Abcam, USA）孵育过夜，然后在避光室温下用AF488标记的山羊抗兔IgG（H + L）二抗（ab150113, Abcam, USA）孵育2 h。用DAPI（1 μg/mL）复染细胞核1 min。每个孵育步骤后，用PBS洗涤细胞三次。用激光共聚焦显微镜观察染色细胞，使用ImageJ软件量化平均荧光强度。

2.5. 体内植入及生物相容性评价
为评估支架的体内生物相容性和降解情况，将SDCM和SNCM（10 × 10 mm）皮下植入小鼠双侧椎旁区域。在植入后4、8和12周收获植入物及其周围组织，进行降解的宏观评估。同时收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的主要器官，进行组织形态学分析。用苏木精-伊红（H&E）对组织切片进行染色，以评估潜在的系统性毒性，并确认SDCM和SNCM的长期生物相容性。

2.6. 体内神经修复效果
2.6.1. 兔胫神经损伤模型
为评估体内神经修复效果，建立了兔胫神经损伤模型。所有动物实验程序均经山东医药大学动物伦理委员会批准，并按规定指南执行。清洁级新西兰白兔随机分为空白对照组、SDCM组和SNCM组（每组n = 6）。通过肌肉注射复合氯胺酮（1.2 mL/kg）诱导麻醉。经股骨外侧切口暴露右侧胫神经，在神经入口点近端2 cm处切断以建立损伤模型。如图S7所示，手术过程包括神经暴露、切断以及随后用测试膜包裹。在空白对照组中，用9-0无损伤缝线将断神经端直接端对端吻合，重新定位后不再做其他处理。对于SDCM和SNCM组，将膜缝合为1 cm长的管状导管，吻合点位于导管中央，两端各用一针固定于神经外膜。术后，所有兔子肌肉注射5%恩诺沙星（2.5 mg/kg）和美洛昔康，每日一次，连续三天，以防止感染并提供镇痛，随后常规饲养。

2.6.2. 吻合口周围组织粘连评估
术后每日观察兔子的整体状况，包括精神状态、饮食、活动和伤口愈合情况。术后2、4、8和12周，用麻醉过量法处死动物。经原切口重新暴露右侧胫神经，将吻合口与周围组织的粘连程度分级为无、轻度、中度或重度。同时评估材料降解和神经瘤形成情况。

2.6.3.

组织学分析

术后第2、4、8和12周，将动物安乐死，并采集吻合口近端和远端各5 mm的神经段。标本经固定、石蜡包埋后切片。切片采用苏木精-伊红（HE）染色，并进行MBP、S100和NF的免疫组织化学染色。免疫组织化学染色包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、血清封闭、一抗和二抗孵育、DAB显色及苏木精复染。所有切片均在光学显微镜下观察，评估神经纤维排列、纤维密度、髓鞘厚度、施万细胞增殖和轴突生长情况。HE、MBP、S100和NF阳性表达率进行了定量分析。

2.6.4 腓肠肌湿重比

在第12周终点，将动物安乐死，分离双侧腓肠肌，吸干后称重。湿重比计算方法为实验侧肌肉重量与对侧对照侧肌肉重量的比值。

2.6.5 有髓神经纤维再生率

术后12周，观察MBP染色切片。每张切片在40倍放大倍数下随机拍摄多个视野，并使用自动图像分析系统进行分析。计数吻合口处近端和远端横切面的轴突数量。有髓神经纤维再生率计算方法为远端神经横切面轴突数量除以近端正常神经横切面轴突数量，再乘以100%。

2.7 统计分析

所有数据均使用OriginPro 9（OriginLab，美国）进行分析，结果以均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。统计显著性水平设定为*p < 0.05。显著性水平标记为*p < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001。

3 结果与讨论

3.1 SNCM的组成分析

对猪坐骨神经来源的无细胞基质膜（SNCM）的主要成分进行了定量分析，结果如图1d所示。胶原被确认为主要结构成分，占干重的66.6% ± 0.8%。除胶原外，SNCM还保留了天然神经细胞外基质的关键生物活性成分，包括层粘连蛋白（7.1 ± 0.5 μg/g）、纤维连接蛋白（8.2 ± 1.9 μg/g）、糖胺聚糖（54.5 ± 18.5 μg/g）和神经生长因子（11.5 ± 1.1 μg/g）。这些数据证实SNCM保留了天然神经基质的核心生化特征谱。

下载：下载高分辨率图像（1004KB）

下载：下载全尺寸图像

图1. SNCM和SDCM的物理化学表征。（a）不同放大倍数下的表面形貌SEM图像。（b）C、O、N、S、P和Ca的元素分布图。（c）带有定量原子百分比的EDX能谱。（d）SNCM中胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和神经生长因子（NGF）的定量分析。（e）FTIR谱图，确认了酰胺I/II和C-O-C官能团的存在。（f）PBS中48 h的体外降解曲线。（g）TGA热重曲线，显示热稳定性。（h）DSC曲线，显示玻璃化转变温度和熔融温度。所有数据以均值±SD表示（n = 3个独立重复）。统计学检验方法和显著性水平的详细描述见第2.8节统计分析。

SNCM保留的组成谱为其在外周神经修复中的潜在应用奠定了关键基础。高含量的胶原提供了三维支架，赋予桥接神经缺损和支持细胞黏附与迁移所需的机械完整性[44]。层粘连蛋白和纤维连接蛋白的保留提供了关键的接触引导信号，引导轴突定向延伸以实现准确的靶器官再神经化[45]。糖胺聚糖参与调控局部水合状态和离子环境，同时调节内源性生长因子的生物利用度和活性。值得注意的是，神经生长因子的存在提供了直接的神经营养支持，促进神经元存活和轴突再生[46]。SNCM中结构、引导和营养元素的整合组合共同模拟了促再生微环境。

为进一步验证酸溶解步骤是否损害了保留的ECM成分的生物活性，通过ELISA方法定量测定了酸处理前后的NGF和糖胺聚糖（GAG）含量。如图S1所示，未处理的SNCM中NGF浓度为46.10 ± 1.29 ng/mL，酸中和后为44.22 ± 1.01 ng/mL，对应保留率为95.92% ± 2.18%（图S1a）。类似地，GAG含量在未处理的SNCM中为8.27 ± 0.11 μg/mL，酸处理后为7.70 ± 0.33 μg/mL，对应保留率为93.15% ± 3.95%（图S1b）。这些高保留率证实酸溶解步骤后大部分NGF和GAGs保持完整，这可能是由于酸性条件温和、温度较低以及ECM微环境的保护所致。尽管并非每种ECM成分都逐一验证，但NGF是最不稳定的生长因子之一，其高保留率连同GAGs的保留，强烈表明层粘连蛋白和纤维连接蛋白等结构蛋白在相同条件下不太可能发生显著变性。

与通用皮肤无细胞基质（如SDCM）相比，后者可能缺乏这种神经特异性生化组成，SNCM源自天然神经组织。这一来源赋予了其固有的生物学优势。因此，在兔腓神经损伤模型中应用时，SNCM被认为不仅充当惰性的结构通道，更是一个提供协同物理和生化信号的生物活性基质。这种多功能角色有望增强定向轴突再生、施万细胞定植以及最终的功能恢复。值得注意的是，目前可商用的神经包裹材料（如胶原膜）主要提供机械屏障作用，但通常缺乏SNCM中保留的多种ECM提示信号和生长因子。因此，除了作为有效的物理屏障外，SNCM还提供了更接近天然神经组织的生物活性生态位。尽管如此，SNCM与这些临床使用的商业产品之间的直接头对头比较，是在临床转化之前未来验证的关键下一步。

3.2 物理化学表征

3.2.1 脱细胞效率验证

首先通过组织学染色和DNA分析验证脱细胞过程的效率。如图S2所示，新鲜SDCM和SNCM组织的H&E染色和DAPI染色显示大量细胞核，经脱细胞处理后完全消除。琼脂糖凝胶电泳进一步证实（图S3），脱细胞样品中无高分子量DNA条带，确认基因组DNA被完全去除。定量分析进一步显示，残留DNA含量大幅下降至SDCM为1.50 ng/mg干重，SNCM为1.20 ng/mg干重。两个数值均远低于可移植无细胞基质广泛接受的安全阈值50 ng DNA/mg干重。综合来看，这些结果证实我们的温和脱细胞方案有效去除了细胞抗原，同时保留了细胞外基质结构的完整性。

3.2.2 结构、形貌与元素表征

SDCM和SNCM的化学结构通过FTIR光谱进行验证（图1e）。两种样品均显示出对应于聚合物骨架的特征吸收峰，包括2924和2854 cm?1处-CH?-基团的不对称和对称伸缩振动、1745 cm?1处的CO伸缩振动、1650和1550 cm?1处CONH的酰胺I和酰胺II振动，以及1157 cm?1处的C-O-C醚键。虽然主要官能团保持完整，但SNCM在CONH和C-O-C区域的吸收强度明显增强，表明其细胞外基质（ECM）组成更丰富。

为进一步研究这些基质的物理形貌和元素分布，扫描电子显微镜（SEM）分析（图1a）显示，猪坐骨神经来源的无细胞基质膜（SNCM）和猪皮肤来源的无细胞基质膜（SDCM）均呈现粗糙平面表面，无纤维结构。与SDCM相比，SNCM表面形貌更为均匀致密。元素分布图（图1b）和能量色散X射线光谱（EDX）分析（图1c）显示两种材料的元素组成存在明显差异。SDCM主要含有碳（C）、氧（O）和氮（N），而SNCM还显示出硫（S）、磷（P）和钙（Ca）的显著信号。定量EDX数据显示，SNCM中碳的原子百分比（51.1% ± 0.4%）略高于SDCM（45.8% ± 0.4%），而SNCM中的氧含量（24.0% ± 0.5%）低于SDCM（29.9% ± 0.2%）。

这些形貌和元素发现，连同FTIR结果，佐证了组成分析，并进一步阐明了SNCM作为神经修复支架的潜在优势。SNCM更为均匀致密的表面，尽管缺乏纤维取向，可能提供了有利于细胞黏附和铺展的稳定拓扑界面，与其高胶原含量赋予的机械支撑一致。SNCM中硫信号增强可能源于硫酸乙酰肝素等硫酸化糖胺聚糖，这与先前检测到的糖胺聚糖含量（54.5 ± 18.5 μg/g）一致，并表明这些分子参与生长因子的结合和呈递。磷和钙的检测表明SNCM基质中保留了膜相关磷脂和钙结合信号成分。

这种更复杂的元素分布反映了SNCM的神经来源特性，其基质组成在生化复杂性上超越了以胶原为主的SDCM组成。综合来看，SNCM不仅表现出更优的生物活性成分保留，还具有增强的表面均匀性和元素复杂性，更准确地模拟了天然神经细胞外基质。这种涵盖组成、形貌和元素分布的多层次仿生特征使SNCM成为外周神经修复的有力支架候选。应用于腓神经损伤时，SNCM有望提供具有神经特异性生化提示信号和离子平衡的有利界面微环境，从而协同促进施万细胞功能和轴突再生。

3.2.3 体外降解行为

为评估材料在生理环境中的稳定性，在PBS中评估了SNCM和SDCM的体外降解。两种材料表现出显著不同的降解动力学（图1f）。SDCM降解迅速，6 h内质量损失超过70%（73.6% ± 7.3%），8 h时完全降解。相比之下，SNCM经历缓慢且持续的降解过程，在4、6、8、10、14、18和24 h时的质量损失率分别为12.1% ± 0.7%、15.9% ± 2.5%、25.1% ± 4.5%、32.3% ± 4.3%、35.8% ± 2.8%、51.1% ± 8.2%和74.2% ± 3.7%，直到48 h才完全降解。这些结果表明SNCM比SDCM具有更优的体外稳定性。

SNCM和SDCM之间降解行为的显著差异可归因于其不同的微观结构和组成特征，这与先前表征结果一致。SDCM的快速降解与其在SEM中观察到的相对粗糙疏松的微观结构相关，这可能促进了在水环境中快速水合、溶胀和结构崩解。相比之下，SNCM更为均匀致密的表面有效减缓了水分子和离子的渗透，从而延缓了分解过程，导致降解动力学减缓。

从根本上说，降解行为的差异源于成分差异。SDCM主要由胶原组成，其在PBS中的降解主要受物理溶胀和溶解驱动。除胶原外，SNCM保留了丰富的硫酸化糖胺聚糖，如硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素，如先前组成和元素分析所证实。这些带负电荷的多糖可通过离子作用和氢键与胶原网络整合，形成更稳定且交联的细胞外基质复合物。此外，SNCM中磷和钙的存在提示可能存在磷酸化蛋白质和钙离子介导的交联，进一步增强基质结构完整性和抗水解性。

这种可控的缓慢降解特性对于SNCM作为神经修复支架的应用至关重要。理想的支架应在早期再生阶段维持结构完整性，为细胞迁移和轴突延伸提供持续的物理引导。SDCM在8 h内快速降解未能满足这一时间需求。相比之下，SNCM在24 h时保留约25%的质量，其48 h降解窗口与损伤后的关键早期事件更为匹配，包括施万细胞激活、迁移和基底膜重建。此外，这种缓慢降解特性在理论上有利于嵌入的NGF等神经营养因子在再生微环境中长期保留和局部可用性。因此，SNCM更优的体外稳定性结合其独特的神经来源组成，为其在外周神经修复中的有前景应用奠定了材料基础。后续体内研究需要验证其降解行为与神经再生过程之间的相关性。

3.2.4 热学和机械性能

通过TGA和DSC进一步评估样品的热稳定性和相变（图1g、h）。TGA曲线显示，10%质量损失温度（T??%），作为初始热降解的关键指标，从SDCM的98.2°C显著升高至SNCM的154.9°C。

差示扫描量热法（DSC）分析显示，玻璃化转变温度（Tg）从SDCM的85.5 °C略微降至SNCM的75.6 °C，这很可能归因于增塑效应引起的链段运动性增加。相反，熔点（Tm）从108.7 °C升至134.2 °C，分解温度（Td）从210.4 °C升至266.3 °C。综合来看，Tm、Td及T90%值的升高表明，尽管Tg略有下降，SNCM相比SDCM具有更有序的结晶结构和显著增强的热稳定性。
SNCM和SDCM的拉伸力学性能通过万能试验机进行表征，结果如图2a1–2a5和图S4所示。SDCM的断裂伸长率为14.5 ± 2.9%，最大应力为8.5 ± 2.4 MPa，最大拉伸力为7.1 ± 2.5 N，杨氏模量为177.7 ± 12.3 MPa。相比之下，SNCM在所有参数上均表现出更优的力学性能：断裂伸长率为46.9 ± 6.4%（提高3.2倍），最大应力为26.3 ± 2.8 MPa（提高3.1倍），最大拉伸力为21.5 ± 1.8 N（提高3.0倍），杨氏模量为328.8 ± 6.5 MPa（提高1.85倍）。
下载：下载高分辨率图像（790 KB） 下载：下载全尺寸图像
图2. SDCM和SNCM的理化性质与血液相容性表征。(a1–a2) 典型应力-应变曲线；(a3) 拉伸力-位移曲线；(a4) 断裂伸长率与最大拉伸力；(a5) 抗拉强度与杨氏模量。(b) 保水率。(c) 在pH 4.5、7.4和8.0的PBS中12小时的溶胀行为。(d) 血液凝固指数。(e) 溶血率。(f) 血液凝固（上排）与溶血（下排）的代表性图像。(g) 不同时间点的水接触角测量。(h) 接触角定量分析。所有数据以均值 ± 标准差表示（n = 3次独立重复）。
SNCM增强的力学性能源于其高交联密度和稳定的微观结构。元素分析显示SNCM中含有硫、磷和钙，表明硫酸化糖胺聚糖产生了强静电交联，并可能通过磷酸化或钙介导的相互作用实现稳定。这些多重相互作用与SEM观察到的均匀致密微观结构相结合，形成了一个高度整合的网络，能够抵抗更大的拉伸应力。
值得注意的是，SNCM的杨氏模量显著高于天然神经本体。然而，这一差异并不妨碍其适用于神经修复。天然外周神经的机械性能因物种和解剖层次不同而存在很大差异；例如，啮齿动物坐骨神经的模量范围为小鼠约4.6 MPa至大鼠约19.2 MPa，而猪神经束膜和神经外膜的模量分别约为3.0 MPa和0.4 MPa [47], [48]。此外，脱细胞处理本身会增加刚度。以往研究表明，脱细胞神经移植物（S-ANA）的模量可达约32 MPa，这是由于胶原蛋白的波浪形结构丧失和纤维排列度增加所致 [49]。更重要的是，SNCM被用作薄而柔韧的包裹膜，其功能上更关注抗拉强度和抗撕裂性，而非与神经本体的完全匹配。其高断裂伸长率（46.9%）确保了足够的柔韧性，以适应神经运动而不产生压迫。因此，这些力学特性针对其作为耐用抗粘连屏障的预期应用进行了合理优化。结合其增强的热稳定性，这种多尺度结构完整性使SNCM成为外周神经修复的有前景材料。
3.2.5. 保水性、溶胀性与亲水性
为评估材料的流体相关特性，系统表征了SNCM和SDCM的保水率、pH依赖性溶胀行为及表面亲水性。保水性测试（图2b）显示，SNCM的保水率为93.1 ± 0.02%，显著高于SDCM（82.9 ± 0.006%），表明SNCM具有更优的持水能力。
溶胀行为测试（图2c）揭示了两种材料在不同pH条件（4.5、7.4和8.0）下溶胀动力学的显著差异。在所有pH条件下，SDCM均表现出快速且极高的溶胀率，在生理pH 7.4下12小时达到509.5%，在酸性和碱性条件下均超过460%。相比之下，SNCM表现出显著受限且稳定的溶胀行为，在pH 7.4下12小时的溶胀率仅为223.1%，在pH 4.5和8.0下分别为160.3%和222.2%。值得注意的是，SNCM的溶胀对pH变化不敏感，表现出优异的尺寸稳定性。
接触角测量（图2 g和2 h）显示两种材料的初始接触角相似，SNCM为109.6° ± 3.2°，SDCM为109.3° ± 16.7°，表明两者表面均呈疏水性。两种材料的接触角随时间逐渐减小，SNCM在60 s时为95.6° ± 7.7°，略高于SDCM（91.4° ± 12.1°），表明SNCM的表面疏水性略强。
SNCM与SDCM在流体相关特性上的显著差异可归因于其不同的组成特征、交联密度及微观结构，这与前述表征结果一致。SNCM更高的保水率和更稳定的溶胀行为主要源于其复杂致密的细胞外基质（ECM）网络。SNCM富含硫酸化糖胺聚糖，其丰富的极性基团通过氢键有效结合水分子，从而赋予其优异的持水能力。更重要的是，这些组分与胶原网络之间通过静电相互作用和离子键形成的多重高密度交联构建了一个结构稳定的三维网络，极大限制了水的渗透，导致其溶胀率仅为SDCM的40–50%，且对pH变化不敏感。相比之下，SDCM主要由胶原组成，结构松散且交联密度低，易允许水分子渗入，导致快速过度溶胀。
两种材料相似的初始表面疏水性以及SNCM略强的疏水性可能与其微观结构特征有关。SEM观察显示SNCM表面更为致密均匀，减少了液滴铺展的毛细作用；同时其亲水基团主要位于内部网络中，对表面自由能的贡献极小。
这些流体相关特性对SNCM作为神经修复支架的应用具有重要意义。SNCM优异的持水能力有助于维持湿润的局部微环境，促进细胞粘附和营养交换。其低且可控的溶胀行为尤为关键，因为过度溶胀会在体内产生膨胀压力，压迫再生的神经组织，可能导致结构变形或缝合线断裂。SNCM稳定的低溶胀性有效避免了这些问题，确保支架在体内保持预期尺寸和形状，为轴突再生提供持久稳定的物理通道。综上所述，SNCM凭借其独特组成和高交联结构，表现出高保水性、低而稳定的溶胀行为以及适中的表面疏水性，为神经再生提供了更安全可靠的支架平台。
3.3. 血液相容性分析
血液凝固指数测试结果如图2d所示，其中较低的BCI表示更优的凝血能力[39]。对照组（纯血）设定为100%。SDCM表现出中等促凝活性，BCI为72.7% ± 1.3%。相比之下，SNCM表现出更优的促凝能力，BCI显著较低，为52.6% ± 0.6%（图2f上排）。肉眼凝血图像证实了这些结果：对照血液保持液态，SDCM显示部分血块形成且有明显液相，而SNCM完全凝固为固态凝胶状物质，几乎无残留液体。SNCM的优异促凝能力可归因于其独特的神经衍生细胞外基质组成和表面特性。SEM观察显示其致密纤维网络提供了丰富的表面积和血小板粘附及纤维蛋白网络形成的锚定位点。SNCM保留了多种生物活性成分，特别是硫酸化糖胺聚糖，其负电荷通过静电相互作用吸附阳离子蛋白和血小板。同时，胶原作为血小板激活的有效底物，暴露了可直接激活血小板糖蛋白受体的特异性结合位点。相比之下，尽管SDCM含有胶原，但其组成较简单，缺乏多种促凝信号的协同效应，导致活性较弱。
溶血率测试结果如图2e所示。阳性对照（Triton X-100）表现出完全溶血，而阴性对照（PBS）设定为0%基线。SDCM的溶血率为3.4% ± 0.2%，SNCM为1.6% ± 0.2%，均远低于5%的国际安全阈值（图2f下排）。红细胞形态图像显示，两种材料均表现出与阴性对照相似的红细胞沉淀，上清液清澈，无明显溶血。值得注意的是，SNCM的溶血率显著低于SDCM，表明其能更好地保护红细胞膜完整性。极低的溶血率与脱细胞处理过程相关，该过程有效去除了细胞成分并保留了生物相容性细胞外基质。SNCM较低的溶血率可能归因于SEM观察到的其更为均匀致密的表面，减少了剪切应力和对红细胞的机械损伤。此外，SNCM中保留的硫酸化糖胺聚糖可能形成水化层，减少材料与红细胞膜的直接接触。
优异的血液相容性是生物材料临床应用的关键前提[33]；值得注意的是，SNCM卓越的血液相容性为其神经修复应用带来了显著优势。其快速凝血能力可迅速控制术中出血并减少血肿形成，为再生创造稳定的初始微环境；同时，其适度的促凝活性促进早期血块形成，作为雪旺细胞迁移和轴突生长的临时支架。极低的溶血率确保长期血液接触的安全性，避免溶血引起的炎症反应。高效的促凝活性与极低的溶血率相结合，连同其已验证的降解行为、机械性能和神经衍生生物活性，使SNCM成为一种有前景的神经修复多功能材料，有望在临床转化中实现更好的止血效果和组织再生结果。
3.4. 细胞内活性氧检测与免疫调节活性
采用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，通过评估细胞内活性氧（ROS）水平和一氧化氮（NO）产量，评价了SNCM和SDCM的免疫调节作用（图3）。荧光显微镜显示，LPS刺激诱导了强绿色荧光，表明ROS生成旺盛，而与SNCM或SDCM共培养后该现象显著减弱（图3a）。定量分析证实，两种材料处理组的平均荧光强度均显著低于LPS对照组（图3b）。流式细胞术进一步证实了这些发现，显示两组中DCF阳性细胞比例均显著降低（图3d, e）。此外，LPS刺激显著增强了巨噬细胞的NO产量，该作用也被SNCM或SDCM共培养所抑制（图3c）。这些结果表明，两种材料均能有效缓解LPS诱导的巨噬细胞内ROS和NO过度产生[18]。
下载：下载高分辨率图像（1 MB） 下载：下载全尺寸图像
图3. SNCM和SDCM在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中的免疫调节活性。(a) 不同放大倍数（100×、200×和400×）下DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平的典型荧光显微镜图像。(b) DCFH-DA染色的校正总细胞荧光（CTCF）强度定量分析。(c) 采用格里斯试剂测定的一氧化氮（NO）产量。(d) ROS阳性细胞的流式细胞术分析。(e) ROS阳性细胞群的定量分析。(f) CD86表达的典型流式细胞术直方图。(g) CD206表达的典型流式细胞术直方图。(h) CD206+细胞百分比定量分析。(i) CD86+细胞百分比定量分析。所有数据以均值 ± 标准差表示（n = 3次独立生物学重复）。
为进一步验证SNCM对巨噬细胞表型的免疫调节作用，我们对LPS刺激的巨噬细胞进行了M1（CD86, YA0512, Immunoway）和M2（CD206, AK22830, Elabscience）标记物的流式细胞术分析（图3f–3i）。如图3h所示，与LPS组和SDCM组相比，SNCM处理显著上调了CD206阳性细胞的百分比（p < 0.05），表明M2极化增强。相反，与LPS组相比，SNCM显著下调了CD86阳性细胞的百分比（图3i, p < 0.001）。这些结果表明，SNCM不仅抑制氧化应激，还积极促进巨噬细胞向抗炎型M2表型极化。
观察到的免疫调节活性可能源于材料不同的细胞外基质组成。两种材料可能通过其表面特性调节LPS与巨噬细胞的相互作用，从而减弱炎症信号。SDCM主要依赖其胶原成分，而SNCM保留了额外的生物活性分子，如硫酸化糖胺聚糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白。这些成分可能通过多种潜在途径发挥抗氧化和抗炎作用，包括LPS吸附、自由基清除以及调节细胞行为，从而可能赋予SNCM更优的免疫调节能力。

值得注意的是，SNCM促进M2极化的能力可能归因于其保留的神经营养因子和特异性细胞外基质结构域，这些成分已被证明可以促进巨噬细胞向促再生表型转变。这一免疫调节特性对于神经修复应用尤为重要。周围神经损伤后，可控炎症对于碎片清除是必需的，但过度炎症会导致氧化应激并阻碍再生。通过抑制巨噬细胞来源的ROS和NO过度产生，同时促进M2极化，SNCM可能有助于调节局部炎症，减轻氧化损伤，并促进有利于施万细胞活性和轴突生长的促再生微环境[50]。结合其之前已验证的降解特性、机械性能和血液相容性，SNCM代表了一种有前景的多功能支架，能够通过调节局部炎症环境促进功能恢复。

3.5 体外细胞相容性评价
采用MTT实验和Calcein-AM/PI活/死细胞染色法，使用L929成纤维细胞评估了SNCM和SDCM的细胞相容性，结果如图4所示。MTT实验结果表明，以空白对照组设为100%，SDCM浸提液组的细胞活力为91.2%±0.9%。与SNCM浸提液共培养的细胞显示出显著更高的活力，为114.8%±0.9%，高于对照组和SDCM组，表明SNCM具有促增殖作用（图4b）。所有实验组的细胞活力均高于90%，远超70%的毒性阈值，表明两种材料均无细胞毒性。

下载：下载高分辨率图像（471KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 使用L929成纤维细胞评估的SNCM和SDCM的体外细胞相容性。（a）活/死染色代表性荧光图像。活细胞用Calcein-AM染色（绿色），死细胞用PI染色（红色）。（b）MTT实验评估的细胞活力。（c）活细胞比例的定量分析。所有数据均以均值±标准差表示（n=3个独立生物学重复）。

活/死染色进一步证实了这些发现（图4a）。对照组细胞表现出典型的成纤维细胞形态，铺展良好，活细胞比例为40.5±6.1%。与材料浸提液共培养显著提高了细胞存活率：SDCM组的活细胞比例增至88.4±0.08%，SNCM组达到96.4±0.5%，显著优于对照组和SDCM组（图4c）。荧光图像证实，SNCM组显示细胞密度高且铺展良好，视野中绿色荧光活细胞占主导。

两种材料均表现出良好的细胞相容性，这归因于脱细胞过程保留了天然细胞外基质成分。值得注意的是，与SDCM相比，SNCM在细胞活力（114.8%）和活细胞比例（96.4%）方面表现更优，显示出明显的促存活和促增殖作用。这一优势可能与SNCM独特的神经衍生细胞外基质组成有关，其保留了包括层粘连蛋白（7.1±0.5μg/g）、纤连蛋白（8.2±1.9μg/g）和神经生长因子（11.5±1.1μg/g）在内的生物活性分子。这些成分可能通过提供黏附配体和神经营养支持来促进细胞存活和增殖。相比之下，主要由胶原组成的SDCM缺乏这些特异性生物活性分子的协同作用。

这种优异的细胞相容性对SNCM作为神经修复支架具有重要现实意义。在周围神经再生过程中，施万细胞和成纤维细胞等关键细胞的迁移、增殖和功能至关重要。通过提供有利的黏附基质和生物活性信号，SNCM可能为这些细胞创造支持性微环境[51]。

3.6 未分化PC12细胞的增殖和分化
采用未分化PC12细胞评估了SNCM和SDCM对神经细胞行为的影响，通过CCK-8实验检测增殖并观察形态变化，结果如图S5所示。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，SDCM对细胞增殖无显著影响，而SNCM在所有时间点均表现出轻度抑制增殖的作用（图S5b）。形态学观察显示，对照组和SDCM组中大多数细胞在培养期间保持圆形或短梭形的未分化状态，仅偶见短突起。值得注意的是，SNCM组中的细胞从第3天开始延伸出细长突起；随着时间推移，大量细胞发育出明显的轴突样纤维，到第7天，这些突起相互连接形成密集的神经元样网络（图S5a）。分化率定量分析进一步证实，SNCM组在第7天的分化率显著高于对照组和SDCM组（图S5c）。

SNCM的促分化和抗增殖作用可能与其独特的神经衍生细胞外基质组成有关。增殖减缓是细胞启动分化程序时常见的伴随现象。SNCM保留了包括神经生长因子、层粘连蛋白、纤连蛋白和硫酸化糖胺聚糖在内的生物活性分子，如前文组成分析所示。这些成分可能共同模拟促神经分化微环境，从而诱导PC12细胞向神经元样表型分化。相比之下，虽然SDCM主要由胶原组成，但缺乏这些特异性促分化生物活性分子，导致对PC12细胞分化无显著促进作用。

SNCM促进PC12细胞分化的能力对其作为神经修复材料的应用具有重要意义。在周围神经再生过程中，促进神经元样细胞的轴突延伸和功能成熟至关重要。通过提供神经营养因子和细胞外基质信号，SNCM可能支持体内再生轴突的生长。结合其之前已验证的降解特性、机械性能、细胞相容性和免疫调节活性，SNCM显示出作为多功能神经修复材料的潜力。基于这些发现，进一步进行了调查以分析分化后PC12细胞的黏附、迁移、增殖和分化表型。

3.7 分化后PC12细胞的迁移、增殖和细胞骨架染色
采用Transwell实验、划痕实验、CCK-8法和鬼笔环肽染色系统地评估了SNCM和SDCM对分化后PC12细胞迁移、增殖和细胞骨架形态的影响，结果如图5所示。

下载：下载高分辨率图像（1MB）
下载：下载全尺寸图像
图5. SNCM和SDCM对分化后PC12细胞迁移、增殖和细胞骨架组织的影响。（a）Transwell迁移实验代表性图像。（b）0、6和24小时划痕实验代表性图像。（c）鬼笔环肽染色（F-肌动蛋白，绿色）和DAPI（细胞核，蓝色）代表性荧光图像。（d）1、3、5和7天CCK-8实验评估的细胞增殖。（e）Transwell实验中迁移细胞的定量分析。（f）伤口闭合率的定量分析。（g）鬼笔环肽染色荧光强度的定量分析。所有数据均以均值±标准差表示（n=3个独立生物学重复）。

Transwell迁移实验结果显示，对照组迁移细胞数为8.7±2.3，SDCM组为14.3±3.2，与对照组无显著差异。相比之下，SNCM组迁移细胞数显著更高，为336±74.8，大幅超过对照组和SDCM组（图5a, e）。划痕实验进一步证实了这些发现。培养6小时后，对照组伤口闭合率为45.2%±6.5%，SDCM组为63.5%±4.8%，SNCM组为97.9%±1.9%。到24小时，SNCM组的伤口完全闭合（图5b, f）。SNCM强大的促迁移作用归因于其独特的神经衍生细胞外基质组成。SNCM保留的生物活性分子，包括层粘连蛋白、纤连蛋白和神经生长因子，通过提供细胞黏附配体和趋化信号协同促进细胞定向迁移。SDCM主要由胶原组成，缺乏这些特异性促迁移生物活性分子，因此效果有限[22], [52]。

CCK-8实验结果表明，在培养第1、3、5和7天，SNCM组的细胞活力在所有时间点均显著高于对照组和SDCM组，分别达到166.5%、125.0%、127.5%和119.4%，表明SNCM持续促进分化后PC12细胞的增殖（图5d）。SNCM对分化后PC12细胞的持续促增殖作用与在未分化PC12细胞中观察到的促分化和抗增殖作用形成对比，表明SNCM的生物活性是细胞状态依赖性的。SNCM保留的成分，包括神经生长因子和硫酸化糖胺聚糖，通过提供神经营养支持并促进生长因子结合和呈递来促进分化细胞的增殖。

鬼笔环肽染色结果显示，对照组肌动蛋白荧光强度为41.1±0.4，SDCM组为53.1±1.2，SNCM组显著更高，为71.4±2.1。SNCM组表现出更丰富和致密的细胞骨架结构，肌动蛋白丝组织良好且细胞铺展更广泛（图5c, g）。SNCM增强的肌动蛋白细胞骨架组装和组织与其促迁移和促增殖作用密切相关。SNCM保留的层粘连蛋白和纤连蛋白调节肌动蛋白聚合，促进细胞铺展和形态维持，从而为轴突延伸提供结构基础。

SNCM对分化后PC12细胞迁移、增殖和细胞骨架组织的综合促进作用为其在神经修复中的应用提供了依据。在周围神经再生过程中，施万细胞的迁移和增殖对于引导轴突再生至关重要。基于这些发现，进一步进行了调查以分析施万细胞的迁移、增殖和功能表型[53]。

3.8 施万细胞迁移、增殖和免疫荧光染色
采用原代施万细胞通过Transwell实验、划痕实验、CCK-8法、鬼笔环肽染色和S100免疫荧光染色系统地评估了SNCM和SDCM对施万细胞迁移、增殖、细胞骨架形态和功能表型的影响，结果如图6所示。

下载：下载高分辨率图像（1MB）
下载：下载全尺寸图像
图6. SNCM和SDCM对原代施万细胞迁移、增殖、细胞骨架组织和功能表型的影响。（a）Transwell迁移实验图像。（b）0、24、48和64小时划痕实验图像。（c）鬼笔环肽染色（F-肌动蛋白，绿色）和DAPI（细胞核，蓝色）。（d）S100免疫荧光（绿色）与DAPI复染（蓝色）。（e）1、3、5和7天CCK-8增殖实验。（f）迁移细胞数的定量分析。（g）伤口闭合率的定量分析。（h）鬼笔环肽荧光强度的定量分析。（i）S100荧光强度的定量分析。所有数据均以均值±标准差表示（n=3个独立生物学重复）。

在Transwell实验中，SNCM组迁移细胞数（27.3±4.7）显著高于对照组（15.7±0.6）和SDCM组（15.3±4.0）（图6a, f）。划痕实验证实了这一点，SNCM组在48小时时伤口闭合率达到96.5%±5.7%，并在64小时时完全闭合，明显优于对照组和SDCM组（图6b, g）。CCK-8结果显示，SNCM持续促进施万细胞增殖，第7天时细胞活力显著高于对照组和SDCM组（图6e）。鬼笔环肽染色显示，SNCM诱导了更丰富和致密的细胞骨架组织，细胞铺展更广泛（图6c, h）。最后，S100免疫荧光证实SNCM显著上调S100表达，表明更好地维持了施万细胞功能表型（图6d, i）。

这些综合促进作用归因于SNCM独特的神经衍生细胞外基质组成。SNCM保留的生物活性分子，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、硫酸化糖胺聚糖和神经生长因子，提供细胞黏附配体、趋化信号和神经营养支持，协同促进施万细胞定向迁移、增殖、细胞骨架重组和表型维持。相比之下，SDCM缺乏这些特异性促迁移和促增殖生物活性分子，导致效果有限。在周围神经再生过程中，施万细胞的迁移和增殖对于形成Büngner带并引导轴突再生至关重要，其功能状态的维持直接影响再生质量[54]。通过提供适当的细胞外基质信号和神经营养支持，SNCM可能促进体内损伤部位施万细胞的迁移、增殖和功能，从而加速神经再生过程[55], [56]。

3.9 体内安全性评估
为评估体内生物安全性和降解行为，将SDCM和SNCM皮下植入小鼠背部。在4、8和12周监测降解情况，并采集主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和植入部位皮肤进行H&E染色分析（图S6、图7）。

下载：下载高分辨率图像（514KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. SNCM和SDCM的体内生物安全性评估。植入后0、4、8和12周主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和植入部位皮肤的代表性H&E染色图像。未观察到明显病理变化。

大体观察显示，两种材料均在4周时开始出现降解，可见变薄。到8周时，SDCM和SNCM均几乎完全吸收，12周时观察到完全降解和吸收。

在整个研究过程中，植入部位未观察到脓肿或溃疡等急性毒性迹象。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）在所有时间点的H&E染色均显示正常组织结构和细胞形态，与假手术组相当。未发现炎症、充血、水肿或坏死等病理改变，证实12周观察期内不存在全身毒性。植入部位皮肤分析显示，4周时两种材料周围均出现轻度慢性炎症反应（主要为淋巴细胞和巨噬细胞），与正常异物反应一致。该炎症反应随时间推移逐渐消退，至12周时炎症已显著减轻。值得注意的是，在界面处观察到组织长入和整合，未见严重纤维化或致密囊形成，表明两种材料均具有良好的局部生物相容性。总之，SDCM和SNCM均表现出良好的体内生物安全性，未引起全身毒性，仅产生短暂、轻度的局部炎症反应，且该反应随组织整合而消退。其降解特性具有生物相容性，两种材料均在12周内完全降解。这些有利的体内安全性结果，结合其此前已证实的细胞相容性、血液相容性和免疫调节活性，支持其作为神经修复植入材料的潜在适用性。

3.10. 基于兔腓肠神经损伤模型的体内神经修复效果评估

3.10.1. 神经吻合口周围组织粘连评估

术后观察用于评估各组新西兰白兔的一般状况和伤口愈合[3]。于术后12周采集组织样本，评估神经吻合恢复情况及与周围组织的粘连程度，结果见图S7和图8b。

下载：下载高分辨率图片（2MB）下载：下载全尺寸图片

图8. 神经再生及神经吻合口周围组织评估的组织学评价。(a) 再生神经组织的代表性H&E染色（2–12周）和MBP免疫组化染色（12周）。(b) 粘连严重程度的定量分析。(c) HE阳性面积比的定量分析。(d) 有髓神经纤维再生率的定量分析。(e) 有髓神经纤维再生率。所有数据以平均值±标准差表示（n = 3个独立生物学重复）。

术后第一周内，所有组动物均表现出精神状态差、食量减少、活动力下降等症状，至第2周逐渐恢复至术前水平[57]。三个组的手术切口均愈合良好，未见感染或裂开迹象。SDCM和SNCM组的修复膜于术后2周开始降解，至8周时几乎完全吸收。吻合口愈合良好，未见局部红肿或化脓。

术后12周，对每组吻合口与周围组织的粘连程度进行分级和定量分析。对照组中，4只动物表现为严重粘连，2只为中度粘连，2只为轻度粘连，0只为无粘连。SDCM组中，2只表现为严重粘连，2只为中度粘连，4只为轻度粘连，无动物表现为无粘连。SNCM组中，无动物表现为严重粘连，3只为中度粘连，4只为轻度粘连，1只为无粘连。统计分析表明，SNCM组严重粘连的发生率显著低于对照组（P < 0.05）。关于吻合口扩大，对照组中5只动物出现此情况，而SNCM组无动物、SDCM组仅1只动物出现吻合口扩大。

SNCM和SDCM在体内均表现出良好的生物相容性和可降解性。值得注意的是，SNCM组表现最佳，无严重粘连，这可能归因于其良好的降解特性和生物活性成分，有效最小化了慢性炎症和纤维囊形成。结合其此前已验证的细胞相容性、免疫调节活性和神经源性生物活性，两种无细胞基质膜均展现出作为周围神经修复材料的潜在应用前景，其中SNCM在预防术后并发症方面表现更为优越[58]。

3.10.2. 腓肠肌湿重比评估

术后12周，对照组湿重比为0.514 ± 0.085，SDCM组为0.553 ± 0.081，SNCM组为0.614 ± 0.078（图9d；两种材料组与对照组相比均P < 0.05）。值得注意的是，SNCM组在所有组中湿重比最高。腓肠肌湿重比是反映肌肉去神经支配及随后再神经支配的定量指标，两个治疗组的湿重比均显著高于对照组，表明肌肉质量保存更好、功能恢复更优越。

下载：下载高分辨率图片（536KB）下载：下载全尺寸图片

图9. 轴突再生与Schwann细胞激活的免疫组化分析。(a) 术后2、4、8和12周NF（神经丝）和S100染色的代表性免疫荧光图像。(b) NF阳性面积比随时间变化的定量分析。(c) S100阳性面积比随时间变化的定量分析。(d) 术后12周腓肠肌湿重比的定量分析。所有数据以平均值±标准差表示（n = 3个独立生物学重复）。

神经离断后，神经营养支持和神经活性的丧失导致肌肉进行性萎缩，而这种萎缩可通过成功的轴突再生和再神经支配来逆转。SDCM组和SNCM组中显著更高的湿重比证实了无细胞基质包裹在促进神经修复和减轻萎缩方面的有效性。SNCM组表现更优，与其在体外观察到的增强生物活性一致，包括促进PC12细胞神经分化以及刺激Schwann细胞迁移、增殖和激活。SNCM独特的神经源性细胞外基质组成富含层粘连蛋白、纤维连接蛋白和神经营养因子，可能创造了更有利于轴突再生和神经肌肉接头重建的微环境，从而最优地保存了肌肉质量。这些结果表明，SNCM有效促进了靶肌肉的再神经支配，可能通过保留神经营养和细胞外基质信号实现，从而支持其运动恢复潜力。

3.10.3. 神经再生的组织学评估

为阐明功能恢复的组织学基础，分别于术后2、4、8和12周对吻合口处再生神经组织进行H&E染色、S100和神经丝（NF）免疫组化染色，并于12周时进行髓鞘碱性蛋白（MBP）染色（图8a，9a）。对阳性面积比和有髓神经纤维数量进行定量分析（图8c-e，9b-c）。

3.10.3.1. H&E染色

H&E染色显示各组随时间推移呈现渐进性形态学差异[58]（图8a，c）。在2周和4周时，所有组均表现出明显的炎症细胞浸润和组织结构紊乱。至8周时，对照组和SDCM组仍显示神经纤维排列紊乱和明显的结缔组织增生，而SNCM组则开始显示出有序、平行的再生神经束，瘢痕组织减少。至12周时，差异更加明显：对照组表现出最严重的纤维化和结构紊乱，SDCM组显示中度改善，而SNCM组表现出最佳的形态学恢复，神经纤维排列紧密有序，结构与天然神经高度相似。

SNCM组的优越形态学结果提示其具有独特的有序再生指导作用。尽管早期炎症阶段在各组间相似，但SNCM独特地在关键再生阶段（8–12周）促进了有序神经结构的形成。这归因于其神经源性细胞外基质的微结构和生物活性成分，为定向Schwann细胞迁移和轴突生长提供了地形和生化线索，最大限度减少了随机萌芽及随之而来的纤维化。此外，其适当的降解特性确保了持续物理支撑，以维持这一有序再生支架。

3.10.3.2. S100和NF免疫组化

S100和NF免疫组化染色提供了细胞再生的纵向动态视图（图9a）。定量分析显示，所有组的S100和NF表达随时间增加，SNCM组在所有时间点（自第4周起）表现出最高表达水平（P < 0.05）（图9b，c）。值得注意的是，SNCM组中S100和NF的表达趋势高度同步，表明Schwann细胞激活与轴突再生协调进行，其次为SDCM组和对照组。

SNCM组中S100和NF同步且更高的表达表明再生过程紧密协调。上调的S100反映了强大的Schwann细胞激活、增殖和Büngner带形成以引导再生轴突，而增加的NF表达则直接反映了轴突再生的密度和程度。两种标记物优越且同步的升高归因于其神经源性细胞外基质所创造的最适微环境，其中保留的层粘连蛋白和纤维连接蛋白为Schwann细胞迁移和轴突伸长提供了适宜基质，而硫酸化糖胺聚糖可能通过结合并释放内源性神经营养因子进一步增强Schwann细胞活性和轴突生长。

3.10.3.3. MBP染色与有髓神经纤维再生

术后12周的MBP染色揭示了各组间髓鞘化的明显差异（图8a）。对照组表现为微弱且稀疏的信号，有髓纤维少且排列紊乱；SDCM组显示染色明显增强，纤维数量增多且排列更好；而SNCM组则表现出最强且最均匀的染色，有髓纤维丰富、排列紧密，与天然神经组织高度相似。定量分析进一步证实了这些观察结果，显示SNCM组具有最高的MBP阳性有髓神经纤维密度和最高的再生率，其次为SDCM组，组间差异显著（P < 0.05）（图8d-e）。

MBP是髓鞘的关键结构蛋白，其表达直接反映功能性神经成熟程度。SNCM组中MBP阳性纤维数量和再生率显著更高，表明不仅再生轴突数量增加，成功完成再髓鞘化的轴突比例也更大。这些结果与S100和NF的表达模式高度一致，表明SNCM同时促进了轴突再生和髓鞘形成。有效的髓鞘化取决于Schwann细胞与轴突建立一对一关系并包裹轴突。SNCM组的优越结果归因于其神经源性细胞外基质所创造的有利微环境，其中排列整齐、高密度的轴突为Schwann细胞提供了丰富的基质，而层粘连蛋白、纤维连接蛋白和硫酸化糖胺聚糖等生物活性成分可能协同支持了耗能的髓鞘合成过程。

综上所述，这些组织学和免疫组化分析表明，SNCM在周围神经再生的所有阶段均显著优于对照组和SDCM组，从引导有序形态（H&E）到激活Schwann细胞和促进轴突生长（S100/NF），再到促进功能性再髓鞘化（MBP）。这种多阶段增强得益于其神经特异性细胞外基质所提供的结构指导、持续神经营养支持和生物粘附信号的协同组合。这些发现有力地支持SNCM作为有前景的生物活性材料用于临床周围神经修复。

4. 结论

总之，本研究开发了一种猪坐骨神经源性无细胞基质膜（SNCM），保留了天然神经细胞外基质成分，包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、硫酸化糖胺聚糖和神经生长因子。SNCM表现出优越的理化特性，包括可控降解、增强的机械强度和韧性、高持水性、最小膨胀以及良好的血液相容性。在功能方面，SNCM通过清除活性氧和氮氧化物表现出强效免疫调节活性，促进了PC12细胞的神经分化，并增强了Schwann细胞的迁移、增殖及功能表型维持。在兔腓肠神经损伤模型中，SNCM有效预防了神经吻合口周围粘连和神经瘤形成，显著改善了肌肉湿重比，促进了有序的神经形态，协调了Schwann细胞激活、轴突再生和功能再髓鞘化。通过在一个单一仿生平台中整合结构支持、免疫调节功能和神经营养信号，SNCM协调创造了促再生微环境，协同促进全面的周围神经再生，使其成为神经修复领域有前途的临床转化策略。

CRediT作者贡献声明

高秀燕（Xiuyan Gao）：撰写—原稿，资金获取，概念设计。刘昆（Kun Liu）：撰写—原稿，项目管理，数据整理。高永斌（Yongbin Gao）：形式分析。郑红霞（Hongxia Zheng）：调查研究。任晓敏（Xiaomin Ren）：方法论。姚安阳（Anyan Yao）：资源提供。张雨纳（Yuna Zhang）：软件。高毅飞（Yifei Gao）：监督。严欢欢（Huanhuan Yan）：撰写—审阅与编辑，验证，项目管理，资金获取，数据整理。宋晓峰（Xiaofeng Song）：撰写—审阅与编辑，可视化，概念设计。

出版同意

所有作者同意出版。

伦理批准和参与同意

所有研究程序均按照山东医药大学动物伦理委员会批准的实验方案进行。

资金支持

本研究由山东省重点研发计划（编号：2024CXGC010610）、山东省自然科学基金项目（编号：ZR2025MS724）、烟台自然科学基金项目（编号：ZR2025Q015）、山东省高等学校"青年创新团队计划"项目（编号：2022KJ280）、滨州医学院"口腔医学+X"校院融合创新项目（编号：

KQRH2024MS003）以及滨州医学院"医学+X"一期项目（编号：2025CMX1027）。高秀燕|刘坤|高永斌|郑红霞|任小敏|姚安岩|张雨娜|高一帆|严环环|宋晓峰