综述：异戊烯醇利用途径：酶工程、代谢整合及其在微生物萜类生物合成中的应用

《Biotechnology Advances》：The isopentenol utilization pathway: enzyme engineering, metabolic integration, and applications in microbial terpenoid biosynthesis

　　

摘要

萜类化合物是最结构多样、商业价值最高的天然产物之一，广泛应用于药物、香料、香精和生物燃料等领域。如何可控地供应其通用前体异戊烯焦磷酸（IPP）和香叶基焦磷酸（DMAPP），仍然是微生物萜类化合物生产中的核心限制因素。原生的甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径与固醇稳态、中心碳代谢和氧化还原平衡深度耦合。其分散的调控方式、辅因子需求以及随规模变化的瓶颈，使得进一步集约化变得复杂。异戊烯醇利用途径（IUP）提供了一种正交替代方案：一个紧凑的、仅依赖ATP的、以外源醇为供体的旁路，通过两步激酶反应加异构化，将外源异戊烯醇和prenol直接转化为IPP和DMAPP。本综述将IUP视为一个可配置的前体模块，而非单一途径变体。酶水平部分涵盖入口激酶和异戊烯基磷酸激酶的结构、动力学与工程改造，包括经典C5构型中动力学不平衡如何将大部分通量控制集中于第一步磷酸化反应，以及在供体、能量和下游条件如何使控制点转移至其他位置。宿主水平部分探讨表达层级、载体设计、宿主选择与区室化，以及IUP通量与毒性管理、原生前体途径之间的相互作用。无细胞级联反应与技术经济分析则识别出醇类供体旁路优于进一步MVA或MEP优化所能达到的范围及其定量裕度。

引言

萜类化合物是天然产物中最大且结构最为多样的家族，包含超过80,000种化合物，从简单的单萜到高度复杂的二萜和三萜化合物不等（Camara et al., 2024; Li and Tao, 2024）。其惊人的化学多样性支撑了药物、香料与香精、营养保健品以及高级生物燃料等领域的广泛应用，临床上重要的例子包括抗癌药物紫杉醇、抗疟药物青蒿素，以及众多具有抗炎和抗菌活性的生物活性萜类化合物（George et al., 2015）。植物提取和化学合成在可扩展性和成本方面均面临根本性限制（Ma et al., 2021）。微生物细胞工厂提供了一种有吸引力的替代方案，它通过利用可再生碳源进行发酵生产，在枯草芽孢杆菌、酿酒酵母（Wang et al., 2018）以及日益增长的非传统宿主（包括解脂耶氏酵母（Zhang et al., 2023a, Zhang et al., 2023b; Arnesen and Borodina, 2022）和毕赤酵母（Pe?a et al., 2018））中已取得了可观的工程进展。然而，实现具有商业相关性的滴度和产率仍然在很大程度上取决于细胞内萜类前体供应的效率与可控性（George et al., 2015），这是该领域持续存在的限制因素。

萜类化合物源自通用C5构建模块异戊烯焦磷酸（IPP）和香叶基焦磷酸（DMAPP），它们经香叶基转移酶反复缩合形成不同链长的香叶基焦磷酸，作为全部萜类化合物碳骨架的前体。在大多数生物体中，IPP和DMAPP由真核生物和古菌胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径（Lombard and Moreira, 2011），或细菌和植物质体中的甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径提供（Di et al., 2023）。尽管经过数十年的密集工程化改造，两条途径仍难以达到工业性能水平。MVA途径与必需的固醇稳态紧密耦合，其限速酶HMG-CoA还原酶（HMGR）受到转录水平、翻译后及降解水平的反馈调控，主动抵制大幅的通量偏差（Schumacher and DeBose-Boyd, 2021; Faulkner et al., 2024）。MEP途径碳效率更高，但依赖于铁硫酶IspG和IspH，其活性对细胞内氧化还原条件和氧气供应极为敏感，使其在大规模生物反应器中尤为易受氧气和pH梯度的影响（Douw et al., 2025; Misra et al., 2024）。两条途径均施加了可观的NADPH和ATP辅因子需求，与细胞其他需求竞争，且IPP/DMAPP浓度的升高本身具有细胞毒性，窄化了前体安全积累的窗口（图1a）。

尽管机制不同，在高产量水平下，两条途径均呈现出类似的工程化模式，即分散的通量控制和与必需细胞功能的紧密耦合意味着，解除一个瓶颈往往会使限制转移至其他位置，而非消除它；这一模式将在第2.3节中完整分析，正是这一模式激发了人们对与中心代谢调控框架更加独立的前体供应策略的兴趣。在此背景下，以C5醇类为基础的旁路模块（如IUP）为此类解耦架构提供了特别明确的测试案例，其发展是以下各节的重点。

在已提出的克服这些限制的替代策略中，异戊烯醇利用途径（IUP）代表了概念上最具差异性的方法之一。IUP并非通过增加内源前体途径的通量，而是引入一个短链、调控解耦的模块，将外源C5烯丙醇异戊烯醇（3-甲基-3-丁烯-1-醇）和prenol（3-甲基-2-丁烯-1-醇）直接转化为IPP和DMAPP，仅需两步ATP依赖的磷酸化反应（Chatzivasileiou et al., 2019; Zhang et al., 2023a, Zhang et al., 2023b; Pan et al., 2023）（图1b）。IUP概念本身并非由单一设计诞生，而是通过近二十年间一系列基本独立的酶学和代谢工程进展逐步积累而成；图1c概括了这一发展轨迹，从最初鉴定古菌IPK活性到近期构建IUP依赖型（IUPD）宿主菌株，为不熟悉该文献的读者提供了一个简洁的切入点，以便在后续的机理与工程细节之前建立基本认知。一种兼性胆碱或伯醇激酶催化第一步磷酸化生成单磷酸中间体，异戊烯基磷酸激酶（IPK）完成第二步磷酸化生成焦磷酸，异戊烯焦磷酸异构酶（IDI）则将产生的IPP和DMAPP池平衡供下游使用。由于IUP仅以ATP为辅因子，不含氧化还原活性步骤，且利用外源供应的底物而非源自中心代谢的中间物，它大幅减少了MVA-和MEP依赖工程所受的调控纠缠与辅因子竞争。自其在枯草芽孢杆菌中首次证明以来，IUP模块已部署于细菌、酵母、产油真菌、光合微藻及无细胞系统，实现了从数百毫克每升的芳樟醇和香叶醇到克/升级别的番茄红素和albicanol的萜类化合物滴度（Zhang et al., 2023a, Zhang et al., 2023b）。随着领域扩展，来自不同酶家族的入口激酶已被鉴定和工程化，揭示了在底物亲和力和催化效率方面广泛的变化范围，直接塑造途径设计（Ma et al., 2022; Zhang et al., 2023a, Zhang et al., 2023b）。与此同时，结构引导的突变筛选将IPK活性扩展至C10和C15单磷酸底物，将醇类前体供应拓展至C5之外，支持IUP类萜烯醇依赖途径（在下文中定义），后者直接供给GPP和FPP池，而非IPP/DMAPP池。这些进展共同将IUP从孤立的个案研究推进为广泛使用的前体供应架构。现有数据现已使人们不仅能像近期工作所做的那样，对IUP变体和IPK基途径进行编目，还能提出另一类问题，即醇类旁路在何时以及为何提供优于原生MVA和MEP途径进一步优化方案的实用优势。

由于相同的两步磷酸化逻辑已被应用于多个前体层级，我们采用一套显式的术语并在整篇综述中保持一致。经典C5 IUP指外源异戊烯醇或prenol经入口激酶磷酸化为异戊烯基单磷酸或香叶基单磷酸（IP或DMAP），随后经IPK磷酸化为IPP或DMAPP，IDI平衡两个池的路线。这是最初在枯草芽孢杆菌中描述的构型（Chatzivasileiou et al., 2019），也是表1所汇编的大多数研究中所使用的构型，包括所有以异戊烯醇、prenol或异戊烯醇-prenol混合物为供体的实施方案。IUP类萜烯醇依赖途径指对更长的萜烯醇链应用相同磷酸化化学的路线，即通过为C10和C15底物工程化的IPK变体，将香叶醇或法尼醇经相应单磷酸转化为GPP或FPP（Mabanglo et al., 2012; Kumar et al., 2021）。这种区分并非仅是命名上的。两类进入异戊烯类网络的节点不同，因此经典C5 IUP供应通用的IPP和DMAPP池，仍受香叶基转移酶链和IDI介导的平衡作用约束，而IUP类路线直接提供链长已确定的香叶基焦磷酸，绕过上述两者。它们在酶学和底物经济性方面也有差异，因为C10和C15单磷酸所需的IPK变体在C5底物上的活性显著降低（第4.4节），且香叶醇和法尼醇作为供体与异戊烯醇和prenol不可互换。除非文中另有说明，本综述中关于通量控制、每C5单位ATP成本、毒性窗口和供体经济性的陈述均指经典C5 IUP。

早期工作回顾了IPK的性质并概述了多种用于IPP和DMAPP供应的IPK基途径（Zhang et al., 2023a, Zhang et al., 2023b）。本文将专门聚焦于IUP及相关醇类供体模块在萜类生产中的部署。本综述将IUP视为一个正交的前体供应架构——一个在原生途径调控框架之外运行的模块，将通量控制集中于少数可在酶选择、表达设计和工艺条件水平进行调优的变量。与早期主要关注异戊烯基磷酸激酶和IPK基途径枚举的工作不同，我们以IUP本身作为组织单元，强调酶特性、宿主背景和工艺构型如何相互作用以塑造其性能。我们不是编录IUP应用，而是整合当前关于酶生物化学和动力学多样性、宿主水平工程策略和无细胞基准测试的知识，回答一个实际问题，即醇类旁路在何种条件下提供进一步MVA或MEP途径集约化难以匹配的优势。该比较的定性条件在第2.3节和表4 Group A中阐明，相关的定量证据汇总于第6.5节和表4 Group B，其所支持的结论在第8.5节中陈述。

各节摘要

甲羟戊酸途径：工程潜力与调控约束

MVA途径是真核生物和古菌中异戊烯类前体生物合成的主要途径，也是工业酵母中萜类化合物生产的主要工程目标（Lombard and Moreira, 2011; Paramasivan and Mutturi, 2017; Bureau et al., 2023）。从乙酰辅酶A出发，该途径通过一系列依赖ATP和NADPH的反应产生IPP，其中HMG-CoA还原酶（HMGR）催化不可逆的、依赖NADPH的HMG-CoA还原为甲羟戊酸反应；

从途径强化到途径旁路

改善微生物萜类化合物生产的努力长期以来一直集中在强化原生MVA和MEP途径的通量上（Wang et al., 2018; Paramasivan and Mutturi, 2017）。这些方法取得了实质性改善，并实现了多种萜类化合物在工业相关滴度下的生产，标志性例子包括药用单萜和二萜的克/升级乃至数十克/升级生产（Tippmann et al., 2013; Chen et

C5醇类底物：异戊烯醇和prenol

异戊烯醇（3-甲基-3-丁烯-1-醇）和prenol（3-甲基-2-丁烯-1-醇）是醇类旁路模块中使用的主要C5烯丙醇底物。其小分子量和烯丙基结构使得兼性激酶和磷酸酶可以在不大幅重新设计活性位点的条件下接受它们，而生成的单磷酸和焦磷酸可被原生香叶基转移酶处理。目前两种醇均由石化路线和工程化生物基生产供应。

酶水平工程：发现、筛选与定向进化

IUP由天然不对C5烯丙醇起作用的酶构建而成，因此系统筛选兼性候选者是关键的早期步骤。识别一种可用的胆碱或伯醇激酶作为入口酶并将其与高效的古菌IPK配对，定义了经典的双酶模块，也清晰地揭示了动力学不对称性。这一不对称性以及其成立条件将在4.3节中阐述。

入口激酶：多样性、动力学与设计选择

在萜类生物合成中的应用

IUP已被部署用于生产涵盖单萜、单萜、二萜和杂化天然产物的萜类化合物，跨越多种微生物宿主和无细胞系统。所有产品类别和宿主系统的代表性生产数据汇总于表1。

与其孤立地罗列每一例报道案例，本节围绕解释基于 IUP 的前体供给何时及其为何能交付其效果的跨领域原则，对积累的证据进行了组织。

局限性与挑战

第 6 节中记录的工程学成功反映了基于 IUP 的萜类化合物生产取得了相当大的进展，但它们也揭示了尚未完全解决且将决定基于 IUP 的中心策略在工业规模上实际天花板的反复出现的约束。这些系统层面的局限性——底物毒性和狭窄的 C5 醇操作窗口，ATP 负荷和能量管理，底物供给经济学和原料整合，以及遗传稳定性。

来自 IUP 开发的关键经验

此处审查的工作体系指出了几项经验，这些经验超越了 IUP 本身，并影响着微生物细胞工厂中前体供给工程的更广泛挑战。这些局限性及相应的未来设计机会在图 5 中以示意方式总结。首先，IUP 表明，前体形成与天然调控网络之间的有意义解耦既可实现且具有影响力。其两步架构，对 ATP 作为唯一辅因子的要求，

CRediT 作者贡献声明

Ye Chan Kim：撰写 – 初稿，撰写 – 审阅与编辑，构思，调查，可视化。
Youngwoo Na：撰写 – 初稿，撰写 – 审阅与编辑，调查，可视化。
Won Yoon Hwan Choi：调查。
Deok Mo Song：调查。
Pritam Giri：调查。
Sangwoo Joo：调查。
Hyungdon Yun：撰写 – 初稿，撰写 – 审阅与编辑，构思，监督，资金获取。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本论文报告的工作。

致谢

本研究由韩国政府（科学技术信息通信部）资助的韩国国家研究基金会（NRF）拨款支持（项目编号：RS-2025-02303886, RS-2025-23523526, NRF-2022M3J5A1056169, NRF-2022M3J5A1085235, 和 NRF-2022M3A9I3082366），由教育部资助的 NRF 通过基础科学研究计划支持（RS-2026-25475690），由食品药物安全部在 2026 年提供的拨款支持（26202MFDS010），以及由 Konkuk 大学研究人员基金在 2026 年资助（2026-A019-0034）。

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