髓系特异性内源性TRP1-CAR敲入小鼠模型用于黑色素瘤靶向免疫治疗

《ImmunoTargets and Therapy》：A Myeloid-Specific Endogenous TRP1-CAR Knock-in Mouse Model for Melanoma-Targeted Immunotherapy

　　

背景：恶性黑色素瘤侵袭性强且易产生治疗耐药性。嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）疗法在实体瘤治疗中展现出潜力，但传统的离体工程化CAR-M体内持久性有限，给长期安全性评估带来困难。本研究建立了一个髓系特异性、内源性表达酪氨酸酶相关蛋白1（TRP1）-CAR的小鼠模型，以评估其抗肿瘤活性和安全性。 方法：研究人员将TRP1-CAR条件性敲入Rosa26位点，并与溶菌酶2（Lyz2）-Cre小鼠杂交，生成具有髓系特异性TRP1-CAR表达的TRP1-CARM小鼠。通过流式细胞术、组织免疫荧光、组织病理学和血液学评估了基线状态下的CAR信号和生理状况。在体外评估了吞噬作用、细胞毒性和炎症相关基因表达。在两个独立队列中使用同源B16-Fluc-GFP黑色素瘤模型评估了肿瘤生长、生存期、瘤内CD8+ T细胞浸润和组织病理学。 结果：在外周血以及肺、肝和脾中含有F4/80阳性巨噬细胞的区域检测到CAR信号。在基线条件下，所检查的组织未观察到明显的组织病理学异常或血液学变化。TRP1-CARM-BMDMs显示出对B16-Fluc-GFP细胞增强的吞噬和细胞毒性活性，并在共培养系统中伴有炎症相关基因表达的改变。在体内，TRP1-CARM小鼠表现出延迟的肿瘤生长（P < 0.0001）和延长的生存期（P = 0.0005），并伴有增加的瘤内CD8+ T细胞浸润。 结论：该髓系特异性TRP1-CAR敲入模型在体外显示出抗肿瘤活性，并在体内延缓了黑色素瘤的进展。它为研究与持续内源性CAR表达相关的抗肿瘤活性和初步安全性观察提供了一个概念验证框架。

论文解读文章

研究背景与科学问题

恶性黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤癌，晚期患者五年生存率低，传统化疗及靶向治疗易产生耐药性。尽管以PD-1/PD-L1和CTLA-4为靶点的免疫检查点阻断（ICB）疗法改善了部分患者的预后，但仍有高达40-60%的患者出现原发或获得性耐药。在此背景下，过继细胞免疫疗法成为新的希望，如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法虽获FDA批准，但其应用受限于高质量肿瘤组织的获取及肿瘤微环境（TME）的免疫抑制信号。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液瘤中取得巨大成功，但在实体瘤中面临浸润不足和功能耗竭的挑战。

巨噬细胞因其固有的肿瘤归巢特性和强大的实体瘤浸润能力，成为CAR工程化的新兴平台。嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）不仅能通过CAR介导的吞噬作用直接杀伤肿瘤细胞，还能促进CD8⁺ T细胞浸润，弥补T细胞疗法的短板。然而，当前基于离体病毒转导后过继转移的CAR-M研究模式存在显著局限性：输入细胞数量有限、体内持久性差、组织分布不均，难以模拟持续的CAR体内表达，从而限制了对其长期安全性的评估，尤其是针对像酪氨酸酶相关蛋白1（TRP1）这类在正常组织（如黑素细胞和视网膜色素上皮）也有生理性表达的靶抗原。因此，迫切需要建立一个能够同时满足抗肿瘤疗效验证和长期系统性安全性评估需求的实验模型。本研究旨在通过建立一种髓系特异性、内源性表达TRP1-CAR的基因敲入小鼠模型，来解决上述关键问题。

研究方法概述

研究人员利用CRISPR/Cas9技术将编码抗TRP1单链可变区片段（scFv）的CAR表达盒条件性敲入小鼠的Rosa26位点，随后与溶菌酶2（Lyz2）-Cre驱动小鼠杂交，获得了在髓系细胞（主要是巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）中特异性表达TRP1-CAR的TRP1-CAR^M小鼠模型。研究中采用了包括聚合酶链式反应（PCR）基因分型、蛋白质印迹法（Western Blot）、流式细胞术、免疫荧光（IF）染色和苏木精-伊红（H&E）染色在内的多种分子与细胞生物学技术。在体外实验中，从这些小鼠中分离骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），并通过吞噬实验、细胞毒性实验和定量PCR（qPCR）评估其功能。在体内，研究人员建立了同源的B16-Fluc-GFP黑色素瘤皮下移植模型，通过监测肿瘤体积、生物发光成像、生存期以及终点组织学分析来评估抗肿瘤效果。

研究结果

1. TRP1-CAR^M小鼠的建立与基线特征

研究人员成功构建了TRP1-CAR^M小鼠。通过免疫荧光和蛋白质印迹法证实，在肺、肝和脾脏中F4/80阳性巨噬细胞区域可检测到CAR信号。流式细胞术分析显示，在外周血的巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺）、单核细胞（CD45⁺Ly6C⁺）和中性粒细胞（CD45⁺Ly6G⁺）中均检测到tdTomato报告基因阳性细胞。重要的是，在基线状态下，对心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行H&E染色未发现明显组织学异常，外周血血液学参数也未见显著差异，表明内源性CAR表达未引起明显的自发系统毒性。

2. TRP1-CAR^M-BMDMs的体外抗肿瘤活性与炎症基因表达改变

体外实验表明，与对照组相比，TRP1-CAR^M-BMDMs对B16-Fluc-GFP黑色素瘤细胞表现出更强的吞噬效率和更高的细胞毒性。进一步的qPCR分析显示，在与肿瘤细胞共培养后，TRP1-CAR^M-BMDMs组中促炎因子（如Ccl5, Cd80, Nos2）表达上调，而抑炎/M2型标志物（如Cd206, Cd163, Il10, Arg1）表达下调，提示CAR-M可能重塑了肿瘤微环境的免疫状态。

3. TRP1-CAR^M小鼠延缓黑色素瘤生长并增加瘤内CD8⁺ T细胞浸润

在B16-Fluc-GFP黑色素瘤模型中，与对照组相比，TRP1-CAR^M小鼠表现出显著的肿瘤生长延迟和生存期延长。肿瘤组织的H&E染色显示，TRP1-CAR^M组的肿瘤呈现出更松散的细胞排列、散在的坏死灶和更弥漫的炎性细胞浸润。免疫荧光分析证实，在TRP1-CAR^M小鼠的肿瘤组织中可检测到CAR信号，并且瘤内CD8⁺ T细胞的浸润面积显著高于对照组。此外，在荷瘤小鼠的肺、肝、脾中仍可检测到CAR信号，证明了CAR表达的持续性。

总结与讨论

本研究通过基因编辑技术成功建立了一个髓系特异性、内源性表达TRP1-CAR的小鼠模型（TRP1-CAR^M）。该模型克服了传统CAR-M过继转移模型无法模拟持续性CAR体内暴露的缺陷，为评估靶向具有生理性表达抗原的CAR-M疗法的长期疗效和安全性提供了有价值的平台。研究表明，该模型在基线水平未引起明显的组织病理学和血液学毒性，并且在体外和体内均显示出对TRP1阳性黑色素瘤的抗肿瘤活性，其机制可能与增强的巨噬细胞吞噬/杀伤功能以及促进瘤内CD8⁺ T细胞浸润有关。

研究结论翻译：

通过CRISPR/Cas9介导的Rosa26位点敲入，研究人员建立了一个髓系特异性TRP1-CAR小鼠模型。在所检查的条件下，TRP1-CAR^M小鼠在基线时被评估的组织中未显示出明显的组织学异常或血液学变化。TRP1-CAR^M-BMDMs在体外显示出对B16-Fluc-GFP细胞增强的吞噬和细胞毒性活性，并在共培养系统中伴有炎症相关基因表达的改变。在体内，TRP1-CAR^M小鼠表现出延迟的黑色素瘤生长和延长的生存期，同时伴有增加的瘤内CD8⁺ T细胞浸润。这些发现支持使用该模型来研究与内源性TRP1-CAR表达相关的抗肿瘤活性和初步的体内安全性观察。