葡萄牙非囊性纤维化支气管扩张症患者的痰微生物组与临床特征分析

《Pulmonology》：Sputum microbiome and clinical profiles in Portuguese non-cystic fibrosis bronchiectasis patients

　　

摘要专业翻译 背景：支气管扩张症（bronchiectasis，BC）的全球患病率持续上升。本研究旨在表征临床稳定的葡萄牙BC患者的痰微生物组，并将微生物组与临床数据进行关联分析。 方法：纳入非囊性纤维化BC患者，收集单次自发性痰液样本，通过16S rRNA基因测序进行分析。对分类组成、α多样性（Shannon指数）和β多样性（Bray–Curtis）进行分析，并与临床、功能和影像学变量进行相关性分析。 结果：共纳入58例患者（中位年龄58岁）。痰微生物组表现出显著的患者间变异性，可分层为以嗜血杆菌属（Haemophilus，24%）、链球菌属（Streptococcus，24%）、假单胞菌属（Pseudomonas，14%）以及新出现的罗氏菌属/链球菌属（Rothia/Streptococcus，10%）亚型为主的多种不同亚型。嗜血杆菌属和假单胞菌属亚型呈现相反的临床模式，其中假单胞菌属与更严重的疾病相关，表现为第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 s，FEV1）更低、支气管扩张严重程度指数（bronchiectasis severity index，BSI）更高以及弥漫性影像学改变。α多样性在左肺下叶（left lower lobe，LLL）受累的BC患者中显著降低，并与极端血清IgA值相关；β多样性则与支气管扩张严重程度指数、体质指数（body mass index，BMI）和LLL受累显著相关。未发现α或β多样性与肺功能之间的关联。 结论：这项对葡萄牙BC患者痰微生物组的首次表征揭示了显著的异质性以及与疾病严重程度和影像学模式相关的不同微生物亚型。这些结果凸显了宿主–微生物组相互作用和解剖因素在塑造BC表型中的潜在影响。需要更大规模和纵向研究来确认亚型的时间稳定性。

论文解读

一、研究背景与意义

支气管扩张症（bronchiectasis，BC）是一种以支气管不可逆性扩张为特征的慢性呼吸系统疾病，与持续性炎症和反复感染相关，其临床症状严重程度因气道损伤范围和潜在病因而异。BC的病因多样，包括既往感染、原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）、变应性支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）、免疫缺陷、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和重症哮喘等，但近40%的病例仍为特发性。过去十年中，BC的患病率上升了约40%。

BC的病理生理和进展传统上由Cole提出的“恶性循环”模型解释，即感染、炎症、黏液纤毛清除功能受损和气道损伤在自我强化循环中相互维持。近年来的认识已演变为更动态的“涡流模型”，强调这些因素之间的多方向和可变相互作用。慢性感染在维持这一循环和驱动疾病严重程度方面起主导作用。痰液中存在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与更高的急性加重率、更差的生活质量、更高的住院和死亡风险相关。在葡萄牙，慢性感染铜绿假单胞菌或其他细菌（如洋葱伯克霍尔德菌，Burkholderia cenocepacia）的BC患者也表现出更差的预后。

传统的痰液培养方法无法真实反映这些慢性感染气道中的细菌群落全貌。不依赖培养的技术揭示了BC成人痰液和支气管肺泡灌洗液中除传统病原体（如P. aeruginosa、流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae和肺炎链球菌Streptococcus pneumonia）外，还存在韦荣球菌属（Veillonella）、普雷沃菌属（Prevotella）和奈瑟菌属（Neisseria）等培养方法难以检出的菌属。既往研究显示微生物组组成存在显著差异，可能受疾病严重程度、既往抗生素使用、环境暴露、合并症和地理差异等因素影响，这凸显了研究不同人群的重要性。本研究的主要目的是分析临床稳定且入组前至少1个月未接受吸入或口服长期抗生素治疗的葡萄牙BC患者气道细菌群落的组成和多样性，寻找微生物组亚型，并将微生物数据与临床特征（包括人口学、功能和影像学发现）相关联。这是首次对葡萄牙BC患者痰微生物组进行的表征研究，具有填补区域数据空白的意义。

二、研究设计与关键方法

研究人员从葡萄牙波尔图ULSSJ（Unidade Local de Saúde de S?o Jo?o）门诊纳入58例BC患者（2022至2023年间），纳入标准为年龄≥12岁、经高分辨率计算机断层扫描（HRCT）确诊BC、能自发产生痰液、临床稳定且签署知情同意。排除囊性纤维化或近1个月内接受长期吸入抗生素或大环内酯类药物治疗的患者。临床稳定性定义为数据收集前4周内无急性加重和治疗变更。慢性感染定义为入组前12个月内至少间隔3个月两次或以上培养出同一细菌。

主要技术方法包括：收集自发性痰液样本并冻存于?80°C；采用Sputasol处理痰液后进行细菌DNA提取；对16S rRNA基因的338F/806R引物对进行PCR扩增；在Illumina NovaSeq 6000平台进行双端250测序；使用DADA2方法鉴定扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs），基于Silva数据库138.1版进行分类学注释；使用Primer v7计算多样性指数并进行β多样性多变量分析（ANOSIM和PERMANOVA）；使用STAMP2.1.3和ANCOM-BC v2进行组间差异分析和Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正。同时收集患者血液样本评估血常规、血沉（ESR）、C反应蛋白、α-1抗胰蛋白酶、免疫球蛋白和维生素D水平，并获取最近一次肺功能测定和BC影像学特征数据。

三、研究结果

患者特征：共纳入58例患者，34例（59%）为女性，62%为在职人员，中位年龄58岁（范围17–87岁）。BC病因包括：特发性（n=23，40%）、感染后（n=11，19%）、PCD（n=7，12%）、哮喘（n=6，10%）及其他（19%）。基于mMRC呼吸困难量表，28%为0级，45%为1级，26%为2级，2%为3级。根据Murray量表，3%的痰液为黏液性，72%为黏液脓性，16%为脓性，9%为高度脓性。

分类学特征与α多样性：从痰液样本中鉴定出超过10,000个ASVs，聚为2,027个分类群，其中1,395个分类群鉴定至属水平。最常检出的属包括嗜血杆菌属、链球菌属、假单胞菌属、罗氏菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属、孪生球菌属、梭杆菌属、放线菌属、纤毛菌属、奈瑟菌属等。门水平上以假单胞菌门（Pseudomonadota，36%）和芽孢杆菌门（Bacillota，30%）为主。Shannon多样性指数均值为4.40（±1.01），范围1.31至6.35。

根据优势菌属（单一属占比>20%定义为优势，多个属各≥20%定义为共优势）将患者分为不同亚型：嗜血杆菌属和链球菌属各14例（各24.1%），假单胞菌属8例（13.8%），罗氏菌属/链球菌属共优势6例（10.3%），莫拉菌属4例（6.9%），罕见亚型（葡萄球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、支原体属）共7例，5例（9%）无明确优势菌属且多样性极高。嗜血杆菌属与假单胞菌属呈负相关关系。Shannon多样性在无明确亚型组最高（均值5.91），在葡萄球菌属、罗氏菌属/链球菌属和嗜血杆菌属亚型中较低（均值≤4）。

痰微生物组与慢性感染：58例中34例（59%）存在细菌慢性感染，其中铜绿假单胞菌18例、流感嗜血杆菌8例、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌3例、支气管败血波氏菌2例，产气肠杆菌、奇异变形杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌各1例。34例中20例（59%）的既往慢性感染菌出现在痰微生物组最丰富的五个分类群中，4例（12%）未能检出既往慢性感染菌。STAMP分析确认既往慢性感染患者痰微生物组中假单胞菌属丰度增加。

痰微生物组与BC病因：PCD患者的样本属于链球菌属或嗜血杆菌属亚型，特发性BC占罗氏菌属/链球菌属亚型6例中的5例。其他病因的患者中未发现特定病因与特定亚型的明确关联。

临床变量与微生物组亚型、α和β多样性：嗜血杆菌属亚型在早发型（<6岁）患者中占优势，而罗氏菌属/链球菌属与晚发型疾病相关。嗜血杆菌属亚型中86%的患者嗜酸性粒细胞计数低，50%合并慢性鼻窦炎。肺功能方面，普雷沃菌属、假单胞菌属和莫拉菌属亚型的平均FEV₁%预计值较低（分别为63.4%、58.5%和49.1%），而嗜血杆菌属、链球菌属、罗氏菌属/链球菌属及其他亚型均>70%。假单胞菌属亚型与弥漫性BC（同时存在圆柱状、静脉曲张状和囊状改变）相关，并与吸入性皮质类固醇治疗密切相关。

α多样性在左肺下叶（LLL）受累患者中显著降低（p=0.020）。低IgA患者Shannon多样性显著高于高IgA患者（p<0.050）。未发现α多样性与肺功能或其他变量的关联。

β多样性分析与BSI显著相关（p=0.034，但PERMANOVA未确认，需谨慎解读），BSI最高（9–11分）的患者分布于假单胞菌属、链球菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属和无明确亚型组。STAMP比较显示嗜血杆菌属亚型主要见于轻度BSI，假单胞菌属亚型主要见于重度BSI。β多样性还与BMI（p=0.004）、ESR（p=0.018）和LLL受累（p=0.037）显著相关（均经PERMANOVA确认）。ANCOM-BC分析显示高BSI患者中假单胞菌属差异最显著。

四、讨论与结论

讨论部分指出，这是继Seixas等人之后对葡萄牙人群肺微生物组的进一步探索，也是首次针对葡萄牙BC患者痰微生物组的研究。研究结果与欧洲及其他地区既往BC研究一致，以嗜血杆菌属、链球菌属和假单胞菌属为主，同时检出罗氏菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属等既往报道的菌属。所有患者均处于临床稳定且未使用抗生素的状态，降低了微生物组短暂改变的可能性。研究支持BC人群中存在不同微生物亚型，如嗜血杆菌属和假单胞菌属，并提示平衡的微生物群落可能在减轻严重疾病和进行性炎症中发挥潜在保护作用。

研究同时强调了传统培养方法在捕捉微生物多样性方面的局限性。培养与测序结果有时一致（尤其对假单胞菌属、葡萄球菌属和嗜血杆菌属），但培养方法常漏检许多其他细菌，甚至漏检链球菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属和莫拉菌属等优势菌。本研究中也观察到既往培养确定的慢性感染菌在数月后的微生物组分析中未被检出的情况，这可能反映培养灵敏度有限以及慢性感染定义（12个月内仅需两次阳性培养）可能未完全捕捉真正持续感染的问题。研究还证实了假单胞菌属和嗜血杆菌属亚型之间的竞争关系，尤其在慢性定植患者中。罗氏菌属/链球菌属亚型较为罕见，罗氏菌属在肺部的作用仍不确定。

临床关联方面，假单胞菌属亚型患者临床状况较差，表现为低FEV₁、严重BSI、更弥漫复杂的影像学特征，且通常与慢性感染相关。莫拉菌属和普雷沃菌属亚型虽不常见，但也与低FEV₁相关。嗜血杆菌属和链球菌属亚型更多与轻至中度BSI、较高FEV₁、PCD病因相关，嗜血杆菌属亚型还与极早发病（<6岁）和慢性鼻窦炎相关。罗氏菌属/链球菌属亚型与BC症状晚发和特发性BC相关。

关于α多样性，文献报道低α多样性与更严重BC相关，但本研究未发现Shannon多样性与肺功能之间的相关性。LLL受累与α多样性降低相关，可能与下叶解剖特征导致分泌物淤滞和清除受损有关。α多样性还与极端IgA值相关，IgA缺乏患者多样性更高，而高IgA患者多样性降低，提示不同表型的存在。

研究局限性包括：样本量相对较小且为特定临床稳定且未使用抗生素的BC患者亚群，可能降低统计效力；多数患者居住于葡萄牙北部，气道微生物组可能受区域环境和生活方式影响；痰液样本可能包含上气道和口腔微生物的贡献；免疫缺陷患者数量少；研究为横断面设计，单次采样无法评估纵向稳定性或建立因果关系。

结论翻译：本研究首次对临床稳定的葡萄牙BC患者的痰微生物组进行了表征。尽管临床稳定且未接受抗生素治疗，微生物组仍表现出较高的患者间变异性，可分层为以嗜血杆菌属、链球菌属和假单胞菌属为主的多种不同亚型，以及新出现的罗氏菌属/链球菌属亚型。嗜血杆菌属和假单胞菌属亚型尤为不同，其中假单胞菌属与更大的疾病严重程度相关。α和β多样性均可能与LLL的BC相关，值得进一步关注，并支持解剖特征在塑造微生物群落中的潜在重要性。与IgA水平、发病年龄和严重程度指数的关联进一步提示宿主–微生物组相互作用促成了BC临床表型的异质性。微生物组特征可能影响未来BC治疗决策，特别是在靶向抗生素管理方面。未来涉及更大患者群体的纵向研究对于评估这些微生物亚型的时间稳定性及其在BC进展中的作用，以及验证可作为生物标志物的分类群差异至关重要。