《Ecological Indicators》：Unraveling long-term trends and drivers of fish biodiversity change using eDNA metabarcoding of archived samples
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来自德国存档样本的最长淡水鱼类环境DNA（eDNA）时间序列（17年）。原生鱼类在半数样点出现下降；入侵虾虎鱼在所有河流中扩张。序列读数丰度与占据率趋势相关，支持环境DNA（eDNA）的半定量应用。存档悬浮颗粒物（suspended particulate m
来自德国存档样本的最长淡水鱼类环境DNA（eDNA）时间序列（17年）。原生鱼类在半数样点出现下降；入侵虾虎鱼在所有河流中扩张。序列读数丰度与占据率趋势相关，支持环境DNA（eDNA）的半定量应用。存档悬浮颗粒物（suspended particulate matter, SPM）宏条形码分析可实现生物多样性与污染的双重评估。
长期时间序列数据对生物多样性研究与监测至关重要，而淡水生态系统正面临快速且复杂的环境变化。鱼类作为敏感生物指示物，其群落动态可反映生态系统健康，但传统监测受限于时间分辨率、空间覆盖度和成本。环境DNA宏条形码（eDNA metabarcoding）为非侵入性、经济高效的物种检测提供了新途径，然而历史eDNA数据极为稀缺。德国环境样本库（German Environmental Specimen Bank, ESB）长期冷冻存档的悬浮颗粒物（suspended particulate matter, SPM）样本为追溯分析提供了独特资源。研究人员利用2005—2021年间来自德国6条主要河流13个采样点的211份年度SPM样本，通过eDNA宏条形码技术重建鱼类群落变化，并检验三个假设：eDNA时间序列能否捕获鱼类多样性的时空趋势；识别出的模式是否与常规监测一致；环境理化参数是否与群落变化相关。结果表明，该方法成功检测到63个鱼类分类单元，揭示了原生鱼类在近半数样点下降而入侵虾虎鱼持续扩张的趋势，序列读数丰度与占据率变化趋势显著相关，且环境变量解释了部分群落变异。该研究证实存档SPM可作为双重用途监测基质，将生物多样性评估与污染监测整合于同一监测框架，为长期生态评估和循证管理提供了有力工具。
研究人员采用的关键技术方法包括：从德国环境样本库（ESB）的液氮冷冻存档中获取6条河流13个位点的年度SPM合并样本（多瑙河与萨尔河起始时间较晚，共211份）；每份样本进行双份DNA提取和四份PCR重复，使用tele02引物扩增12S基因片段，在Illumina NovaSeq 6000平台测序；原始数据经APSCALE-GUI流程处理，以97%相似度聚类为操作分类单元（operational taxonomic units, OTU），并依据Midori2数据库进行物种注释，保留淡水鱼类；下游分析采用Mann-Kendall检验、广义加性模型（Generalized Additive Models, GAM）、贝叶斯层次模型、Hill数多样性、Beta多样性分解、冗余分析（Redundancy Analysis, RDA）及随机森林等方法，并与常规监测数据进行对比验证。
3.1 Overall diversity（总体多样性）
经生物信息学过滤后，共获得205,054,790条读数，归属310个OTU，对应63个分类单元；每个样点-年份的物种丰富度为5—35种（均值±标准差：18.7±6.2）。检测到的物种均符合德国红名单和常规监测记录，且能反映河流特有分布模式（如多瑙河特有种和河口物种），证明数据生态学上合理。
3.2 Species richness trends per site（各样点物种丰富度趋势）
Mann-Kendall检验显示三个样点（Blankenese、Weil、Jochenstein）丰富度显著下降，Prossen接近显著（p=0.052）。GAM分析确认Weil、Prossen和Jochenstein呈显著负趋势，且模式包含线性和非线性形式。
3.3 Trends by trait categories（按生态类群划分的趋势）
除Koblenz外，所有样点至少一个类群有显著变化。常见种在46%的样点显著下降；濒危种在31%样点下降、31%上升；非本地种在46%样点上升；敏感种在31%样点下降；耐受种在23%样点下降；洄游种在31%样点下降、23%上升。表明常见种和敏感种面临压力，而非本地种持续扩张。
3.4 Correlation between relative reads and site occupancy trends（相对读数与占据率趋势的相关性）
25个物种（40%）表现出显著时间变化，占据率与相对读数趋势显著正相关（Spearman rho=0.56, p<0.001）。入侵的圆虾虎鱼（Neogobius melanostomus）与原生河鲈（Perca fluviatilis）在两种度量中均显著上升，而Barbatula barbatula、Lota lota等显著下降。两种度量的一致性支持eDNA信号的半定量解释。
3.5 Spatiotemporal community change（时空群落变化）
样点内时间周转随时间显著增加（Bray-Curtis与Jaccard不相似性均显著上升），Beta多样性分解表明物种替换（turnover）为主导驱动；样点间空间差异性亦增加（仅Bray-Curtis显著）。Hill数分析显示11个样点丰富度下降，其中4个显著；仅Koblenz和Güdingen的Shannon和Simpson多样性显著上升。热图显示Abramis brama相对丰度下降，而Neogobius melanostomus上升。
3.6 Fish species relative read abundance trends（鱼类相对读数丰度趋势）
贝叶斯层次模型估计显示，83%的物种（52种）相对读数比例稳定；7种显著下降，以Abramis brama、Blicca bjoerkna和Barbatula barbatula最明显；4种显著上升，以Neogobius melanostomus和Perca fluviatilis最强。对于可估计样点特异斜率的42种，所有显著总体趋势均在各样点方向上一致，但部分物种仅在局部样点有显著变化。
3.7 Comparison of eDNA and traditional fish monitoring trend estimates（eDNA与常规监测趋势比较）
与德国常规监测数据（2004—2020年，5497个样点）中共同出现的47种鱼进行比较，74.5%的物种趋势方向一致；Spearman相关系数为0.550（p<0.001），Cohen's kappa为0.471，Wilcoxon检验无显著系统偏差，Bland-Altman分析显示平均差为?0.043。表明尽管采样设计和度量方式不同，两种方法得出的趋势大体一致。
3.8 Physicochemical driver analysis（理化驱动因子分析）
83个环境参数中42个（51%）与物种丰富度显著相关。污染物和物理压力参数（如流量、有机氯农药、粉砂、叶绿素a）多呈负相关，而营养盐（磷、氮）和铁等呈正相关。物种水平分析显示亚硝酸盐、铵氮、溶解有机碳、重金属和多种多环芳烃与多数物种负相关，氧气、磷和铁则与较多物种正相关。冗余分析（RDA）解释28.6%的群落组成变异，沉积物和金属贡献最大；控制空间结构后解释率降至5.5%，控制空间与时间后仍保留1.8%的显著效应。随机森林模型显著预测物种丰富度（R2=0.178），关键预测因子包括汞、流量、氯化物和总无机碳。
讨论部分总结了三个假设的验证情况。假设1得到支持：eDNA时间序列揭示了丰富度下降、类群特异趋势、群落周转增强以及入侵种扩张，但物种丰富度作为单一指标可能掩盖复杂的生态响应，相对读数数据需结合占据率共同解释。假设2得到支持：eDNA与常规监测数据在大方向上一致，差异主要来自检测偏差和采样设计差异，两者可互补。假设3得到支持：环境变量解释了近30%的群落变异，但大部分归因于空间差异；污染物、沉积物和物理梯度与鱼类多样性相关，强调多压力源综合管理的重要性。结论部分可翻译为：这项为期17年的分析表明，对存档悬浮颗粒物样本进行环境DNA宏条形码分析，为河流生态系统长期生物多样性评估提供了有效工具。该方法能够从相同的标准化样本中同时重建生物趋势与理化压力源，将生物多样性监测与污染评估整合于同一框架，支持“一体化健康”（One Health）和早期预警视角。鱼类群落动态，包括物种入侵和分布区变化，可以被回顾性地重建和持续追踪，其时间分辨率与覆盖数千样点的常规监测项目相当且总体一致。因此，存档SPM可作为双重用途监测基质，在环境样本库中连接分子生物多样性评估与化学分析。将该方法扩展至更多分类群，将实现与理化参数关联的多类群生态系统监测；这一整合框架衔接化学与生物监测，为全球生物多样性保护和环境保护背景下的循证管理提供支持。
