山羊初乳和成熟乳中乳铁蛋白的位点特异性糖蛋白组学分析

《Food Bioscience》：Site-specific Glycoproteomic Analysis of Lactoferrin in Goat Colostrum and Mature Milk

　　乳铁蛋白（LF）是一种N-糖基化蛋白，其独特的糖基形式由N-糖链构成，在婴儿的生长发育中发挥着重要的生物学功能。然而，关于初乳乳铁蛋白（CLF）和成熟乳乳铁蛋白（MLF）之间N-糖基化差异的深入科学证据仍然缺乏。本研究中，纯化的CLF和MLF纯度分别达到99.8%和95%。采用位点特异性糖蛋白质组学技术，对纯化的CLF和MLF的糖基化位点和糖基形式进行了系统比较分析。在CLF中鉴定出4个糖基化位点（Asn545、Asn233、Asn368、Asn179）、45种N-糖链和8个糖肽；而在MLF中鉴定出6个糖基化位点（Asn545、Asn233、Asn368、Asn179、Asn476、Asn168）、62种N-糖链和10个糖肽。CLF的甘露糖含量（42.9%）显著高于MLF（33.2%）。MLF中富集杂合型和复合型糖链，表现出更加多样的糖链类型模式，包括未修饰（既不岩藻糖基化也不唾液酸化）、仅岩藻糖基化、仅唾液酸化和唾液酸-岩藻糖基化糖链的数量均有所增加。在N-糖链组成方面，CLF呈现出以少量高丰度糖链为主的聚焦型分布特征，而MLF则表现出更大的糖链异质性，各单个糖链组成的丰度均较低。即使在如Asn368等共同糖基化位点上，CLF和MLF的N-糖基化图谱也存在差异。MLF特有的糖基化位点Asn476主要表现出杂合型和复合型糖链结构。研究结果揭示了CLF和MLF中N-糖基化的异质性，丰富了对山羊乳铁蛋白在不同泌乳阶段N-糖基化的理解。**引言**山羊奶被认为是有价值的生物活性蛋白质来源，具有潜在的保健功效。乳铁蛋白（LF）是乳清中含量丰富的生物活性蛋白，在山羊奶中的含量明显高于牛奶（Ma, Hou, Xie, Zhang, & Zhou, 2021）。山羊乳铁蛋白与牛乳铁蛋白之间的差异不仅限于含量，还延伸至分子结构，这主要取决于铁饱和度水平及糖基化水平（Xia et al., 2023; Zhang et al., 2024）。根据铁饱和度水平，天然LF通常呈现10-20%的饱和度。饱和度低于5%的形式被定义为Apo-LF，而介于76%到100%之间的则被称为Holo-LF（Sui, Roginski, Williams, Versteeg, & Wan, 2010; Voswinkel, Vogel, & Kulozik, 2016）。LF在其Apo、Native和Holo三种形式中的三维构象存在差异，从而调节其物理化学性质和功能行为（Bokkhim, Bansal, Grondahl, & Bhandari, 2013; Gonzalez-Chavez, Arevalo-Gallegos, & Rascon-Cruz, 2009）。不同物种间LF的结构差异主要归因于N-糖基化，包括糖基化位点、糖链结构和糖基形式的差异（Zhang et al., 2024）。N-糖基化可以以高频率发生，N-糖链通过N-糖苷键共价连接到LF的天冬酰胺（Asn）残基上。宏观异质性指的是具有多个N-糖基化位点的蛋白质上各个位点占据的不同排列组合，具体而言是指某个特定的Asn残基是否被糖链占据。而微观异质性则指每个单独糖基化位点上糖链结构的多样性（Hatakeyama, Hossler, Mulukutla, & Hu, 2007）。所有N-糖链都具有共同的核心结构，以N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖起始，随后被修饰为高甘露糖型、复合型或杂合型。复杂多样的修饰赋予LF多种生物学功能。例如，LF通过其糖胺聚糖结合能力特异性地抑制IL-8与硫酸肝素之间的相互作用（Elass, Masson, Mazurier, & Legrand, 2002）。这一机制可以归因于LF所携带的糖链经常介导蛋白质与配体之间的相互作用。此外，不同种类的N-糖链已知调控着不同的生物学功能。LF糖链的岩藻糖基化对于其与肠绒毛刷状缘膜受体的特异性结合至关重要，从而介导牛奶中的高铁生物利用率（Davidson, 1988）。LF的唾液酸糖链介导其对早期神经发育、认知增强和神经保护的有益作用（Wang, 2016）。因此，N-糖蛋白的生物学功能与其N-糖链的特性密切相关。然而，LF的N-糖链在泌乳过程中也会发生变化，这在牛奶中已有报道（Jia et al., 2021; Valk-Weeber, Eshuis-de Ruiter, Dijkhuizen, & van Leeuwen, 2020; Zhang et al., 2025）。在激素调控下，乳腺细胞在不同泌乳阶段表现出不同的特征，首先是LF含量的差异。在山羊初乳中，LF含量为0.455-2.0 mg/mL，而成熟山羊奶中为0.02-0.2 mg/mL（Claeys et al., 2014; Rachman, Maheswari, & Bachroem, 2015）。同时，不同泌乳期间的产量差异可能会影响高尔基体中糖链的加工时间，从而导致LF在每个阶段形成不同的N-糖链图谱（Valk-Weeber et al., 2020）。我们之前的研究在山羊成熟乳铁蛋白中鉴定出Asn 233、Asn 545、Asn 368和Asn 476位点，而山羊初乳LF的糖基化模式仍然未知（Zhang et al., 2024）。Gnanesh Kumar, Lijina, Jinesh, 和 Anagha（2022）在山羊LF的Asn 252和Asn 564位点发现了高甘露糖型、复合型及杂合型糖链，而在Asn 387位点仅发现唾液酸复合型糖链，Asn 495位点则表现出较低的甘露糖含量，主要由复合型和杂合型糖链结构组成。Zhang et al.（2025）对山羊初乳、过渡乳和成熟乳中LF的N-糖链修饰类型进行了定量分析，发现岩藻糖基化和唾液酸化N-糖链在初乳中特别丰富，而中性N-糖链和高甘露糖N-糖链在过渡乳中最为丰富。然而，他们并未整理出各糖基化位点之间的N-糖链异质性。在过去二十年中，质谱（MS）技术已成为研究糖蛋白的主要技术，其研究携带天然糖链结构的糖肽，已成为各领域的优选方法（Bagdonaite et al., 2022）。基于质谱的糖蛋白质组学突破使我们能够系统地探索位点特异性糖链，并大大增强了全面彻底表征糖蛋白的能力。糖肽分析的深度不仅涉及低丰度糖肽的灵敏鉴定和定量，还涉及对位点特异性糖链特征的深刻认识。Wang等（2021）通过位点特异性糖蛋白质组学，在人初乳膜结合乳脂球颗粒（MFGM）的221种糖蛋白中鉴定出2617个完整N-糖肽，在人成熟乳MFGM的200种糖蛋白中鉴定出986个完整N-糖肽。Yu等（2025）报道了通过位点特异性糖蛋白质组学在食用燕窝（EBN）中鉴定出127种N-糖蛋白，其中家燕燕窝中72种，洞燕燕窝中63种，分别产生4195和5649个糖肽。因此，糖蛋白质组学成为同时鉴定糖蛋白序列、N-糖基化位点及所附着糖链结构的高级技术工具。然而，仍存在几个关键的知识空白。首先，尽管山羊成熟乳LF的糖基化位点和糖基形式已部分表征（Zhang et al., 2024），但山羊初乳与成熟乳LF之间位点特异性N-糖基化图谱的差异尚未得到系统研究（Gnanesh Kumar et al., 2022; Zhang et al., 2025）。其次，糖链可以调节LF的抗菌和抗病毒活性、肠道免疫应答方向、胃肠降解抵抗力和肠道转运效率，从而影响包括肠-免疫轴、肠-骨轴和肠-脑轴在内的远端通路（Valk-Weeber et al., 2020）。阐明山羊初乳与山羊成熟乳LF的糖链结构差异有助于理解山羊LF在婴儿健康中的作用，并为开发生羊奶源功能性产品及精准优化婴幼儿配方奶粉提供科学依据。因此，本研究旨在提取山羊初乳乳铁蛋白（CLF）和成熟乳乳铁蛋白（MLF）并进行鉴定，比较它们的糖基化特征（包括宏观和微观异质性），同时总结其位点特异性N-糖链图谱。这为理解LF的糖链异质性提供了有价值的见解，并为开发靶向营养应用提供了理论基础。**材料**萨能山羊的初乳和成熟乳采集自山东阳春天润农牧有限公司（中国山东省潍坊市）。初乳样本来自出生后1至3天的80只山羊；成熟乳则来自出生后1个月至5个月的约300只山羊的混合样本。本研究中使用的所有试剂均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。**乳铁蛋白的提取**LF的提取方法参照我们之前的研究（Xia et al., 2023）。LF是……**山羊初乳和成熟乳中分离乳铁蛋白的鉴定**根据SDS-PAGE图谱，图1A中约80 kDa处的电泳条带被鉴定为LF，MLF泳道显示两个清晰的条带。蛋白质1至3通过MALDI-TOF MS/MS鉴定，表3显示它们均为山羊LF，其中蛋白质3属于不同的亚型。Yoshida和Ye（1990）先前的研究为将蛋白质2和蛋白质3分别归为LF亚型a和亚型b提供了依据。山羊CLF（图1B）和MLF（图1C）的纯度……**讨论**在本研究中，我们采用位点特异性糖蛋白质组学，系统比较了山羊初乳和成熟乳中LF的糖基化位点和糖基形式。我们的结果显示，与CLF相比，MLF表现出显著更高的糖基化复杂性，其特征包括更多的糖基化位点（MLF 6个/CLF 4个）（表4）、更大的N-糖链组成多样性（MLF 62种/CLF 45种）（图3B），以及更高的完整N-糖肽丰度（MLF 292个/CLF 198个）（图3A）。并且……**作者贡献声明****周鹏：** 撰写-审阅与编辑、监督、获取资金、构思。**李伟：** 撰写-审阅与编辑。**彭晓雨：** 调查研究。**韩红阳：** 撰写-原稿、方法学、数据管理。**张丽娜：** 撰写-审阅与编辑、监督、项目管理、调查研究、构思。**侯雁梅：** 撰写-审阅与编辑、撰写-原稿、软件、方法学、构思。**王珊珊：** 方法学。**高宇：** 调查研究。**王家祺**……**利益冲突声明**作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些情况可能影响本文报告的工作。**数据可用性**数据将根据要求提供。**利益冲突声明**作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些情况可能影响本文报告的工作。**致谢**本工作得到了国家自然科学基金（32372246）和国家重点研发计划（2022YFD2101504）的支持。侯雁梅|张丽娜|韩红阳|彭晓雨|高宇|王珊珊|王家祺|李伟|周鹏