《Food Chemistry: X》：Regulatory mechanism of leucine-amidated pectin on the gel properties of shrimp surimi as a salt substitute
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为解决低盐虾鱼糜（shrimp surimi）中的凝胶劣化问题，研究人员通过酶法修饰合成了亮氨酸酰胺化果胶（leucine-amidated pectin，Leu-Pe，接枝度21.89%）。Leu-Pe（4.0%）的表观粘度约为天然果胶（native pec
为解决低盐虾鱼糜（shrimp surimi）中的凝胶劣化问题，研究人员通过酶法修饰合成了亮氨酸酰胺化果胶（leucine-amidated pectin，Leu-Pe，接枝度21.89%）。Leu-Pe（4.0%）的表观粘度约为天然果胶（native pectin）的100倍，并形成了以弹性为主导的网络。在低盐鱼糜中，Leu-Pe增强了凝胶特性：硬度、咀嚼性和凝胶强度分别达到6.72 N、17.77 mJ和9.97 N·mm，而持水力（water-holding capacity，WHC）最高达到97.16%。机理分析表明，Leu-Pe促进了有序β-折叠（β-sheet）的形成和二硫键交联，使游离巯基含量降低至254.93 μmol/g。微观结构观察证实了由疏水锚定和氢键驱动的致密丝状网络，该网络有效限制了水分迁移。这些发现表明，Leu-Pe提供了结构增强和优异的水分保持能力，为开发更健康的低盐鱼糜产品提供了一种有效策略。
**亮氨酸酰胺化果胶作为盐替代品调控虾鱼糜凝胶特性的机制解读**
**一、研究背景与科学问题**
虾鱼糜（shrimp surimi）制品因其高蛋白、低脂肪的营养特性和独特的弹性口感，深受全球消费者青睐。在传统鱼糜加工中，食盐（NaCl，通常添加量为2.0%~3.0%）扮演着至关重要的角色：除了提供风味外，盐通过提高离子强度促使肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins，MPs）溶解，进而促进蛋白分子的解折叠和有序三维凝胶网络的形成。然而，世界卫生组织（WHO）报告显示，全球每年约300万人死于与高钠摄入相关的疾病，减盐已成为全球公共卫生领域的优先议题。直接降低盐含量（如低于1.5%）会显著削弱对肌原纤维蛋白的“盐溶效应”，导致蛋白分子无法充分溶解和解折叠，蛋白-蛋白相互作用减弱，最终形成的凝胶网络松散，持水力（water-holding capacity，WHC）下降，质构严重劣化。因此，如何在低盐条件下重建强健的蛋白凝胶网络，成为水产品加工领域亟待解决的关键科学问题。
为改善低盐鱼糜制品的品质，已有研究引入外源多糖亲水胶体（如卡拉胶、海藻酸盐、果胶）。其中，果胶（pectin）因优异的生物相容性而备受关注。然而，天然果胶（native pectin，Na-Pe）的应用存在显著局限性：其富含亲水性羧基和羟基，主要依靠与蛋白质表面带正电荷残基的静电相互作用来稳定网络，在低盐环境或特定pH条件下，这种单一且较弱的作用力往往不足以支撑稳定的凝胶结构。更为关键的是，Na-Pe缺乏疏水基团，难以通过疏水相互作用锚定到肌原纤维蛋白内部暴露的疏水区域，限制了其在复杂肉体系中对凝胶强度的进一步提升。
**二、研究内容与核心发现**
针对上述瓶颈，研究人员基于前期以木瓜蛋白酶（papain）为生物催化剂制备氨基酸酰胺化果胶的创新方法，合成了亮氨酸酰胺化果胶（leucine-amidated pectin，Leu-Pe，接枝度21.89%）。酶法途径较传统化学合成更加绿色、温和，且产物因引入亮氨酸疏水侧链而呈现“高粘度、易凝胶化”的独特性能——亲水主链维持溶解性，疏水侧链则提供蛋白锚定位点并增加分子间物理缠结。基于此，研究人员提出假说：Leu-Pe凭借其独特的两亲性结构，可通过疏水锚定与氢键的协同机制诱导肌原纤维蛋白构象有序化（由α-螺旋向β-折叠转变），同时重构水相微环境，有效补偿低盐条件下的凝胶网络缺陷。
为验证该假说，本研究首次将酶法制备的Leu-Pe应用于低盐虾鱼糜体系，系统探究其作为高效盐替代品的潜力。结果表明，Leu-Pe的添加显著改善了低盐虾鱼糜的凝胶品质：硬度达6.72 N，咀嚼性达17.77 mJ，凝胶强度达9.97 N·mm，内聚性达0.59，各项指标均显著优于低盐空白对照组，接近甚至部分超越高盐对照组。尤为突出的是，Leu-Pe组的WHC高达97.16%，且热失水率最低。这些结果充分表明，Leu-Pe能够有效替代部分食盐，通过强化蛋白-多糖复合网络的结构完整性，显著提升低盐虾鱼糜制品的加工品质和食用品质。
**三、关键技术方法概述**
本研究以南美白对虾（Penaeus vannamei）冷冻去皮虾肉为原料，通过低温酶法合成Leu-Pe：以木瓜蛋白酶为催化剂，在-5°C、氮气保护条件下将L-亮氨酸接枝到果胶主链上，经透析和冻干获得产物。虾鱼糜采用未漂洗工艺，设置高盐对照组（2% NaCl）、低盐空白对照组（1% NaCl）、低盐天然果胶组（1% NaCl+4% Na-Pe）和低盐酰胺化果胶组（1% NaCl+4% Leu-Pe），经两段水浴加热（40°C、30 min；90°C、30 min）形成凝胶。关键表征手段包括：邻苯二甲醛（OPA）法测定接枝度；傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）进行结构表征；流变仪测定稳态剪切、频率扫描和温度扫描；质构仪进行质地剖面分析（TPA）和穿刺试验；低场核磁共振（LF-NMR）分析水分分布；场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察微观形貌；ANS荧光探针法测定表面疏水性，DTNB法测定游离巯基含量。
**四、主要研究结果**
**（1）亮氨酸酰胺化果胶的结构表征与流变性质**
FTIR、XPS、1H NMR和XRD的多维光谱分析共同证实，亮氨酸通过酰胺键（-CO-NH-）共价连接到果胶主链上，赋予分子独特的两亲性特征；XRD图谱显示酰胺化后衍射峰强度显著降低，表明亮氨酸侧链的引入破坏了果胶分子链的有序堆积，使结晶态向无定形态转变，为与肌原纤维蛋白的相互作用提供了更多活性位点和构象自由度。流变学测量表明，4.0% Leu-Pe溶液呈现剪切稀化行为，其表观粘度约为同浓度Na-Pe的100倍；动态频率扫描中，Leu-Pe的储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），表明形成了以弹性为主的凝胶网络；温度扫描显示Leu-Pe网络在20–60°C范围内保持稳定，与虾鱼糜的典型加工温度窗口相匹配。
**（2）虾鱼糜凝胶的质构特性与流变性质**
质构和穿刺试验结果表明，低盐酰胺化果胶组（CSS-Leu）的硬度、咀嚼性和内聚性均显著优于低盐空白组，凝胶强度和破裂力与天然果胶组（CSS-Na）相当，而破裂距离显著大于高盐对照组（CSS-HS），说明Leu-Pe构建的复合网络兼具良好的刚性和变形能力。流变学分析显示，在生鱼糜加热过程中，CSS-Leu组始终保持较高的模量水平和稳定的变化趋势，表明Leu-Pe在加热早期即与肌原纤维蛋白形成稳定的复合网络；熟鱼糜的温度扫描中，CSS-Leu的模量衰减最为平缓，证明该网络具有优良的热稳定性。
**（3）分子机制：表面疏水性与二硫键交联**
CSS-Leu组呈现出较高的表面疏水性和最低的游离巯基含量（254.93 μmol/g）。这表明亮氨酸的疏水侧链不仅增强了蛋白表面的疏水相互作用，还促进了肌原纤维蛋白的有序聚集，使巯基在适当距离内相互接近并形成稳定的二硫键交联，从而构建出兼顾强度与柔韧性的复合凝胶结构。
**（4）水分分布与持水特性**
LF-NMR的T?弛豫分析显示，CSS-Leu组中不易流动水（T??）峰更加对称、基线稳定，自由水（T??）峰向右偏移且强度降低，表明酰胺化果胶通过酰胺基团的氢键网络和疏水侧链形成的疏水微区的协同作用，重构了水相微环境，促使水分从自由态向束缚态转变。CSS-Leu的WHC达到97.16%，且在持续加热过程中始终保持最高的残余质量，表明其在热加工条件下具有卓越的持水稳定性。
**（5）微观结构与蛋白质二级结构**
FE-SEM观察显示，CSS-Leu形成了大量纤细丝状结构相互交织的致密网络，而CSS-HS和CSS-LS则分别呈现疏松多孔和更加稀疏的网络形态，CSS-Na则介于片层多孔与丝状网络之间。FTIR对酰胺I带的去卷积分析表明，CSS-Leu组α-螺旋含量最低（约24%），β-折叠含量最高（约21%，较低盐空白组的15%显著提升），无规卷曲含量最低（约27%），证实Leu-Pe通过疏水相互作用促进了蛋白构象由无序向有序β-折叠的转变。XRD图谱进一步佐证，CSS-Leu的衍射峰强度最高且半峰宽最窄，表明凝胶体系的有序度和结晶性得到显著增强。
**五、总结与研究结论**
综上所述，本研究成功合成了接枝度为21.89%的亮氨酸酰胺化果胶，并证实其作为盐替代品在低盐虾鱼糜中的显著效果。机理层面揭示的多重协同效应包括：亮氨酸疏水侧链增强蛋白表面疏水相互作用，促进肌原纤维蛋白从无规卷曲和α-螺旋向有序β-折叠构象转变（相对含量从15%增至21%），同时诱导适度的二硫键形成，从而提高凝胶体系的结晶度与有序性；酰胺基团构建的氢键网络与疏水侧链形成的疏水微区协同作用，有效限制水分子迁移，实现自由水向束缚水的转化；上述分子间协同效应最终构建出致密均匀的丝状网络结构，在低盐条件下同步实现了凝胶强度与持水力的提升。翻译研究结论如下：本研究通过酶法成功合成了接枝度为21.89%的亮氨酸酰胺化果胶（Leu-Pe）。FTIR、NMR、XPS和XRD等多维光谱分析证实亮氨酸侧链通过酰胺键共价连接到果胶主链，赋予其独特的两亲性结构特征。流变学测量表明Leu-Pe形成了以高粘度（约为天然果胶的100倍）、高弹性（G′>G″）和良好热稳定性为特征的凝胶网络。在应用层面，Leu-Pe的添加显著缓解了低盐虾鱼糜体系中因蛋白溶解不足导致的凝胶劣化，凝胶硬度、咀嚼性和内聚性均大幅优于低盐对照组，凝胶强度与天然果胶组相当并显著超越高盐对照组，持水力高达97.16%且热失水率最低。分子机制研究表明，Leu-Pe通过促进有序β-折叠形成、诱导适度二硫键交联、重构水分分布以及构建致密丝状网络结构等多重协同效应，实现了低盐条件下凝胶强度与持水力的同步提升。该研究证明了Leu-Pe作为高效盐替代品的潜力，为功能性多糖的分子设计和健康肉制品开发提供了理论基础与技术支撑。
