循环外泌体长链非编码 RNA NAMPT 反义链和 SNHG5 作为乳腺癌的新兴生物标志物

《International Journal of Biological Macromolecules》：Circulating exosomal long non-coding RNAs NAMPT-Antisense and SNHG5 as emerging biomarkers in breast cancer

　　

•长链非编码RNA（lncRNAs）是肿瘤发生中的关键参与者。
•外泌体携带lncRNAs，介导癌细胞与肿瘤微环境之间的交叉对话。
•外泌体lncRNA NAMPT-AS和SNHG5在乳腺癌（BC）患者中升高。
•TCGA数据揭示了高/低NAMPT-AS和SNHG5乳腺癌患者的不同分子特征。
•NAMPT-AS和SNHG5是有前景的相互关联的乳腺癌生物标志物和治疗靶点。

引言

乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的癌症，在世界各地每个国家都有发生[1]，[2]。在埃及，乳腺癌是女性中最常见的癌症，占所有癌症类型的近37%，也是埃及女性癌症相关死亡的第二个主要原因[1]。已识别出多种乳腺癌的危险因素，包括遗传性遗传因素以及与生活方式相关的因素，如肥胖、压力、饮食和吸烟[3]。尽管多种诊断和治疗模式不断发展，乳腺癌的死亡率和发病率仍然居高不下[4]。因此，发现新型诊断和/或预后生物标志物对于对抗乳腺癌至关重要。

长链非编码RNA（lncRNAs）是一大类异质性单链RNA，长度超过200个核苷酸，蛋白质编码能力有限[5]。根据其特征、基因位点以及与邻近基因的关系，lncRNAs可归类为六种类型。这些类型包括内含子lncRNA（位于基因内部）、基因间lncRNA（位于基因之间）、反义lncRNA、正义lncRNA、增强子lncRNA和双向lncRNA[6]。lncRNAs在癌症进展中可以发挥两种对立的作用；一些可以作为癌基因，而另一些则可以作为抑癌基因。越来越多的证据表明，lncRNAs在乳腺癌的发展和进展中发挥关键作用[7]。它们可以触发与乳腺癌肿瘤发生相关的各种过程，包括调节细胞生长、迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）、自我更新能力和药物抗性[8]。此外，在临床环境中，许多lncRNAs已被报道为乳腺癌中新兴的循环生物标志物和/或治疗靶点[7]。

作为lncRNAs的载体，外泌体在介导癌细胞与肿瘤微环境（TME）之间的通讯中发挥着关键作用[9]。外泌体是直径在50至150纳米之间的纳米级细胞外囊泡（EVs），由不同细胞分泌[10]。外泌体广泛分布于健康个体和患者的体液中，如血液、尿液、唾液、羊水、脑脊液、淋巴液和胆汁中[11]。这些外泌体充当运输者，将特定的蛋白质、mRNA以及非编码RNA（如微小RNA（miRNAs）和lncRNAs）作为信使之瓶进行转移[12]。它们在多种生理和病理过程中发挥重要作用，作为细胞间通讯和物质交换的介导者[13]。此外，据报道它们在癌症的启动、进展和转移中发挥关键作用[14]。值得注意的是，乳腺癌患者的血浆中外泌体的含量明显高于健康年龄和性别匹配的对照[15]。

有趣的是，在过去的几年中，烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）在癌症研究中受到了广泛关注[16]，[17]。NAMPT是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成的限速酶。在补救途径中，NAMPT将烟酰胺（NAM）转化为烟酰胺单核苷酸（NMN），然后转化为NAD+[18]。值得注意的是，肿瘤细胞似乎比正常细胞更容易受到NAMPT抑制剂的损伤，这使得NAMPT抑制成为一种潜在的抗瘤治疗策略[19]。在恶性肿瘤中，NAMPT在不同类型的癌症中均有过表达的报道，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、骨髓瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤及其他癌[20]。NAMPT是癌症中多方面作用的参与者，调节肿瘤细胞存活、增殖、迁移，影响肿瘤微环境的免疫状态、药物抗性[16]和干性[21]。对于乳腺癌而言，与受试者相比，患者中循环NAMPT水平升高[22]，[23]，而通过miRNAs抑制NAMPT被发现与乳腺癌细胞代谢崩溃和凋亡的显著增加有关[24]。事实上，几种NAMPT抑制剂已进入I/II期临床试验，以研究其抗肿瘤治疗效果，然而剂量限制的毒性和报道的副作用（如血小板减少症）代表了大规模应用的主要障碍[25]。这强调了仔细考虑其他替代方案的迫切需要，如非编码RNA（包括lncRNAs），它们可以帮助调节/调控这一多方面作用的参与者。

lncRNA烟酰胺磷酸核糖转移酶-反义（NAMPT-AS）已被发现在三阴性乳腺癌（TNBC）中高度表达，并与NAMPT相关[26]。在本研究中，作者显示NAMPT-AS从与NAMPT共享的双向启动子转录，标记为活跃染色质（H3K4me3、H3K27ac），并在ENCODE/FANTOM5数据集中显示出增强子样特征。此外，它在转录和转录后水平上调节NAMPT的表达[26]，且其上调与TNBC患者的预后不良有关[26]，[27]。此外，我们实验室最近报道了外泌体NAMPT-AS作为埃及结直肠癌（CRC）患者的潜在新型诊断/预后生物标志物[28]。然而，外泌体NAMPT-AS尚未在乳腺癌中进行研究。

另一个最近在癌症中引起广泛关注的lncRNA是小核仁RNA宿主基因5（SNHG5）[29]。SNHG5至少部分地通过充当多个miRNA（包括miR-154-5p、miR-205-5p、miR-26a-5p、miR-26b、miR-363-3p等）的竞争内源性RNA（ceRNA）来发挥其作用，从而发挥致癌活性，同时海绵吸附miR-25-3p、miR-20a和miR-32来发挥抑癌活性[30]，[31]，[32]。重要的是，其中一些miRNA（如miR-154和miR-26b）也被报道可靶向并抑制NAMPT，从而降低乳腺癌细胞的活力[24]，[33]。因此，在乳腺癌进展中，SNHG5和NAMPT之间可能存在某种相互作用，但远未得到完全阐明。此外，外泌体SNHG5与外泌体NAMPT-AS一样，尚未在乳腺癌中进行研究。

因此，在本研究中，我们试图研究新诊断的埃及乳腺癌患者中循环外泌体lncRNA NAMPT-AS和SNHG5的水平，并与显然健康的志愿者进行比较。此外，我们研究了这些新型外泌体lncRNAs与血清外泌体mRNA NAMPT和循环血清NAMPT蛋白水平的可能关联。此外，我们分析了癌症基因组图谱（TCGA）患者数据，以探索lncRNAs NAMPT-AS和SNHG5与乳腺癌诊断和/或预后的关联。此外，我们进行了多项生物信息学计算机模拟分析，以阐明NAMPT-AS、SNHG5和NAMPT之间的相互作用。据我们所知，这是第一项研究这些潜在关联在乳腺癌患者中的研究。

研究片段

伦理批准声明和样本量

本研究经爱因夏姆斯大学药学院研究伦理委员会（REC）批准（ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC），样本在获得每位受试者的知情同意后收集。本研究按照《赫尔辛基宣言》制定的指南进行，参考了世界医学协会（WMA）关于涉及人类受试者的医学研究伦理指南[34]。

在进行研究之前，我们进行了先验的人口统计学数据和研究参与者组的临床特征

本研究包括40名新诊断的原发性乳腺癌患者，中位年龄45岁（25–80岁），以及28名显然健康的志愿者，中位年龄30岁（20–57岁），满足纳入标准。如表2所示，基于患者数据的发现，22.5%的乳腺癌患者被报告为早期发病（<40岁），而对照组中89.3%在40岁以下。50%的乳腺癌患者在诊断时为绝经前。25%的乳腺癌患者报告阳性……

讨论

在本研究中，我们试图研究乳腺癌患者血清外泌体lncRNA NAMPT-AS和SNHG5的水平，并与健康对照进行比较。我们还研究了它们表达水平与循环NAMPT蛋白水平以及外泌体mRNA NAMPT水平的关联。此外，我们评估了使用外泌体NAMPT-AS和/或SNHG5作为乳腺癌可能诊断预测指标的可能性。有趣的是，两种外泌体NAMPT-AS和SNHG5水平均被发现显著……

结论

本研究结果表明，与健康对照相比，乳腺癌患者血清外泌体lncRNAs NAMPT-AS和SNHG5上调。此外，血清外泌体lncRNAs NAMPT-AS和SNHG5被发现彼此强烈相关，且两者均显示出潜在的诊断效用，以区分乳腺癌患者与对照。此外，TCGA数据分析揭示了NAMPT-AS和SNHG5在乳腺癌样本中均差异表达。高NAMPT-AS/高SNHG5乳腺癌……

缩写

ADIPOQ 脂联素
AJCC 美国癌症联合委员会
ALT 丙氨酸转氨酶
AQP7 水通道蛋白7
AST 天冬氨酸转氨酶
AUC 曲线下面积
BC 乳腺癌
BCA 偶氮二甲酰胺
BIVM-ERCC5 BIVM-ERCC5读通
C14orf180 14号染色体开放阅读框180
C18orf21 18号染色体开放阅读框21
CD 分化簇
CD300LG CD300样分子家族成员G
CD36 CD36分子
cDNA 互补DNA
cDNA 互补DNA
CI 置信区间
CIDEA 细胞死亡诱导DFFA样效应因子A
CIDEC 细胞死亡诱导DFFA样效应因子C
ReadiT 作者署名贡献声明

Sara M. Abdeljalil：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、资源、方法学、调查研究、形式分析。
Sherehan G. Abdelhamid：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、调查研究、形式分析、概念化。
Ramy Ghali：撰写——审阅与编辑、监督、资源。
Montaser B. Yasser：撰写——审阅与编辑、方法学、调查研究、数据……
出版同意书
不适用。

伦理批准和参与同意
本研究经爱因夏姆斯大学药学院研究伦理委员会（REC）批准（ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC），样本在获得每位受试者的知情同意后收集。

资金
本研究未获得公共、商业或非营利部门任何机构的特别拨款。

利益冲突声明
作者声明他们没有利益冲突。

致谢
我们衷心感谢爱因夏姆斯大学医院的成员们在样本收集过程中的热情支持和帮助，以及参与本研究的患者。此外，我们感谢爱因夏姆斯大学医学院临床病理学-血液学教授Nashwa El-Khazragy教授，感谢她对流式细胞术分析的热情支持和帮助，以评估外泌体表面标记物CD63和CD81。

Sara M. Abdeljalil | Sherehan G. Abdelhamid | Ramy Ghali | Montaser B. Yasser | Mohamed M. Kamal | Dina H. Kassem