微藻紫色酸性磷酸酶底物特异性与催化适应性的机制解析

《Chemical Engineering Journal》：Mechanistic insights into the substrate specificity and catalytic adaptability of microalgal purple acid phosphatase

　　

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  CsPAP 通过高空间可塑性降解多种有机磷污染物。
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  产物 AMPA 的疏松结合防止了 CsPAP 中的竞争性抑制。
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  DFT 预测的能量势垒与体外 OPFR 降解动力学一致。
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  CsPAP 介导的 PO 键断裂驱动了体内Pi 同化和 ATP 生物合成。

引言

有机磷污染物（OPPs），包括农业杀虫剂和工业有机磷阻燃剂（OPFRs），是广泛存在的环境污染物 [1]。在限制传统溴化阻燃剂之后，OPFRs 的全球消耗量和环境排放量显著增加 [2]。这些化合物连同常规有机磷杀虫剂，现在频繁在表层水、废水和各种生态基质中被检测到 [1]。OPPs 的化学稳定性、生物蓄积性和毒性对生态安全和人类健康构成了严重威胁 [1], [3]。因此，开发具有成本效益且可持续的修复策略是必要的 [4]。在现有的物理化学和生物处理方法中，酶介导的生物降解提供了一种环境友好的替代方案 [5], [6]。特别是，紫色酸性磷酸酶（PAPs）可以水解多种有机磷底物，释放微生物可以利用的无机磷酸盐（Pi）[7], [8]。

迄今为止，对 PAPs 最全面的了解来自植物系统。在植物中，PAPs 在磷缺乏条件下的磷获取和再动员方面发挥着记录在案的作用 [7], [8]。在磷饥饿时，植物上调多种 PAP 基因，导致这些酶的分泌或细胞内活性增强，从而清除环境或衰老组织中的有机磷 [9], [10], [11]。例如，水稻中的 OsPAP10a 是一种由 Pi 缺乏诱导的根部相关 PAP，其过表达可显著改善细胞外有机磷的利用 [12]。同样，OsPAP26 作为水稻组织间磷再动员的主要 PAP 发挥作用 [13]。多组学分析进一步揭示了多种植物中一系列 Pi 饥饿诱导型 PAPs，证明了 PAPs 在植物适应低磷环境中的保守和关键作用 [14]。

相比之下，关于微藻中 PAPs 的知识仍然有限，只有少数研究涉及这一主题。在水生环境中，微藻通过上调 PAP 表达来响应磷饥饿，使它们能够利用溶解性有机磷作为替代磷源 [15], [16], [17]。与细菌或真菌系统相比，基于微藻的生物修复具有独特的工程优势，包括太阳能驱动运行和同时固定二氧化碳，这与可持续和低碳技术的原则相一致 [18]。我们课题组先前的实验室研究成功证明了表达 PAP（CsPAP）的工程化聚球藻（*Chlorella sorokiniana*）在降解单一农业除草剂草甘膦方面的生物应用 [17]。然而，该研究主要关注生物修复功效，未探索潜在的量子化学机制以及酶对其他持久性污染物的更广泛适用性。具体而言，CsPAP 的催化多功能性是否延伸到结构复杂且庞大的工业 OPFRs 仍属未知。

仅通过传统生化测定来解决这些机制缺口是具有挑战性的且耗时。然而，计算化学和化学信息学提供了以高分辨率研究酶机制的有力工具 [19]。密度泛函理论（DFT）和过渡态搜索算法允许映射反应路径并在原子水平上定量计算动力学能量势垒 [20], [21]。同时，将高通量虚拟筛选与先进的化学信息学工具相结合，提供了传统试错实验筛选的数据驱动替代方案 [22] [23]。通过分析大规模分子对接结果中的理化特征，无监督聚类方法可以快速识别控制酶 - 底物结合的结构因素，为评估各种新兴污染物的降解潜力提供了一种有效的方法 [24], [25]。

在本研究中，采用综合计算和实验方法来研究 CsPAP 对 OPPs 的催化机制和底物范围。首先，使用高通量分子对接和无监督降维聚类来识别 OPP 识别所需的理化特征。接下来，以草甘膦作为模型化合物，进行 DFT 和爬升镜像 nudged 弹性带（CI-NEB）计算，构建本征反应能量景观，比较 CN 和 CP 键的本征热力学和动力学不稳定性。然后，将此计算工作流应用于三种代表性 OPFRs 以预测其本征反应性轮廓。最后，进行体内和体外降解实验以验证计算结果。这项工作阐明了微藻 PAPs 的构效关系，并为评估用于环境修复的生物催化剂提供了理论依据和实用筛选方法。

章节摘要

CsPAP 结构制备与基于分子对接的虚拟筛选

CsPAP 的三维结构此前已使用同源建模进行了构建 [17]。进行基于分子对接的虚拟筛选以评估 CsPAP 对大型有机污染物库的结合亲和力。小分子库下载自两个公共来源，PubChem 中的 Agri_chem 农业化学数据库和 ZINC 中的 ZeroPM 持久性污染物数据库。来自欧盟 ZeroPM 项目的 ZeroPM 数据库存储

CsPAP 可降解小分子污染物的虚拟筛选

作为在微藻中发现的 PAP，CsPAP 已被认为参与有机磷底物的水解 [16], [17]。然而，目前尚无可用于该酶的系统实验结合数据。在机制研究之前，通过同源建模建立了高度可靠的 CsPAP 三维结构，并通过 pLDDT 评分和 Ramachandran 图进行验证（图 S1）。基于此验证结构，因此进行分子对接以生成模拟

结论

本研究建立了微藻来源的 PAP 对多种 OPPs 的分子机制和生态修复潜力。CsPAP 对 OPFRs 的催化降解表现出明显的结构特异性，产生了 TCPP > TBP > TPhP 的动力学层级，这与 DFT 计算预测的本征水解能量势垒表现出一致的趋势。多尺度计算映射确定了主要的催化和结合区域，表明特定的

CRediT 作者贡献声明

Si-Fen Liu：撰写 – 原稿，可视化，方法论，概念化。 Zhong-Hong Zhang：撰写 – 原稿，方法论，形式分析，数据整理。 Wen-Bo Yan：验证，软件，数据整理。 Wen-Yu Deng：验证，资源，调查。 Bin Lin：可视化，验证，方法论。 Wei-Dong Yang：撰写 – 审阅与编辑。 Hong-Ye Li：撰写 – 审阅与编辑。 Yunzi Hu：项目管理，概念化。 Xiang Wang：撰写 – 审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金委员会（52570039）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515012314, 2024A1515030033）、广东省科学技术协会青年科技人才支持计划（SKXRC2025329）、暨南大学优秀研究生培养计划（2025CXY331）以及大学生创新创业训练计划国家级项目（202610559078）的支持。

Si-Fen Liu|Zhong-Hong Zhang|Wen-Bo Yan|Wen-Yu Deng|Bin Lin|Wei-Dong Yang|Hong-Ye Li|Yunzi Hu|Xiang Wang