《Chemical Engineering Journal》：Self-assembled disulfide-appended DNA amplifier nanoparticles for highly accurate intracellular microRNA imaging through an endocytosis independent pathway
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•开发了用于细胞内miRNA成像的自组装二硫键衍生DNA放大器纳米颗粒（GDANPs）。•GDANPs通过巯基介导的摄取实现不依赖胞吞途径的胞质递送。•GSH触发的解聚释放P-HCR放大器，用于灵敏的miRNA检测。•体外和体内实验中，GDANPs相比脂质体递送实现了更优的成
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开发了用于细胞内miRNA成像的自组装二硫键衍生DNA放大器纳米颗粒（GDANPs）。
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GDANPs通过巯基介导的摄取实现不依赖胞吞途径的胞质递送。
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GSH触发的解聚释放P-HCR放大器，用于灵敏的miRNA检测。
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体外和体内实验中，GDANPs相比脂质体递送实现了更优的成像性能。
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该平台为精准癌症诊断和生物医学分析提供了有前景的策略。
引言
微RNA（miRNAs）是一类小分子非编码RNA，在生物发育和疾病进展中发挥深远的调控功能[1]、[2]。miRNA生物标志物的准确分析可显著提高早期诊断准确率、疾病分期和纵向监测水平，从而最终改善患者预后[3]、[4]。传统的miRNA检测方法，如聚合酶链反应（PCR）[5]、微阵列[6]和Northern印迹[7]，虽被广泛使用，但仍局限于体外应用，无法在活细胞内实现原位成像。尽管荧光原位杂交（FISH）等细胞内成像技术可在细胞中实现miRNA的可视化，但其扩增效率仍不足以用于高灵敏度检测[8]。因此，开发稳健的信号扩增策略以评估活细胞中的特定miRNA，对于促进miRNA相关疾病的早期诊断至关重要。
DNA放大器凭借其出色的生物相容性、灵活的设计以及卓越的信号扩增能力，已成为灵敏检测低丰度分析物的前景工具[9]、[10]。特别是，当与荧光成像结合时，杂交链反应（HCR）[11]、熵驱动催化（EDC）[12]和催化发夹组装（CHA）[13]等扩增技术可在活生物系统中执行检测任务。例如，Wang课题组基于HCR、EDC或CHA级联构建了一系列催化DNA回路，用于高效的体内miRNA成像[14]、[15]。尽管取得了这些进展，基于DNA放大器的miRNA成像的广泛应用仍受到细胞内递送效率低下的阻碍[16]、[17]。细胞进入的初始障碍源于带负电荷的DNA放大器与细胞膜之间的强库仑排斥作用[18]。此外，在细胞培养和转染过程中，血清和组织培养基中的核酸酶会迅速降解DNA探针分子的结构完整性[19]。更关键的是，通过传统物理或化学方法递送至细胞内的大多数DNA放大器不可避免地会被隔离在内溶酶体途径中，在那里它们在被酸性水解酶迅速降解之前无法到达细胞质——而细胞质正是其生物功能旨在执行的部位[20]。
为解决这些挑战，人们探索了多种递送载体，包括阳离子脂质体[21]、[22]、无机纳米颗粒[23]、[24]和基于核酸的纳米组装体[25]、[26]，旨在提高DNA放大器的内化效率。例如，基于球形核酸（SNA）的DNA放大器探针因其荧光猝灭能力、改善的细胞通透性和出色的细胞内稳定性等特性而被广泛采用[27]、[28]。与此同时，各种DNA纳米结构，包括Y形DNA[29]、[30]、DNA四面体[31]、[32]和基于DNA折纸的纳米探针[33]，也因其结构可编程性、多功能化修饰以及出色的生物相容性而成为活细胞成像的有力工具。尽管这些尝试在一定程度上提高了核酸探针的稳定性和递送效率，但此类系统仍然依赖于内吞途径，且至今未能从根本上解决内溶酶体捕获问题[34]、[35]。此外，破坏内溶酶体完整性以促进逃逸的策略，如质子海绵效应[36]，存在固有的细胞毒性和炎症风险[37]。最近，不依赖内吞的细胞进入机制，尤其是巯基介导的摄取，因其快速的细胞摄取能力、不依赖内吞的途径以及高效的胞质货物释放而在核酸递送领域引起了大量关注[38]、[39]、[40]。例如，细胞穿透性聚二硫醚（CPDs）已被应用于递送复合物，通过与细胞表面巯基发生巯基-二硫键交换反应，促进蛋白质和RNA干扰寡核苷酸的递送[41]、[42]。Abe及其同事将二硫基团引入siRNA和反义DNA的末端区域，促进了其细胞内化，并在癌变细胞中实现了对目标基因表达的稳健敲低[43]。在我们先前的工作中，我们表明含胍基（Gu+）的二硫键（GD）分子可通过多价盐桥与寡核苷酸形成复合物，驱动二硫键交换聚合并自组装成纳米颗粒[44]。这些自组装的GD-寡核苷酸纳米颗粒通过巯基介导的摄取获得了直接且高效的胞质进入途径。鉴于GD-寡核苷酸纳米颗粒便捷的组装特性及高效的细胞内递送性能，我们预期构建GD-DNA放大器复合物将显著提升DNA放大器的递送效率，与脂质体等传统载体相比，实现对活细胞内miRNA更有效的可视化。
为此，我们研究了GD分子作为辅助剂用于构建二硫键衍生DNA放大器纳米颗粒的潜力，以实现体外和体内高效的miRNA成像（方案1）。在此设计中，选择回文杂交链反应（P-HCR）作为DNA放大器模型，该系统包含两个回文末端链接的DNA哑铃探针（pH 1和pH 2），因其快速反应动力学和出色的检测性能而被选中[45]、[46]。GD分子通过DNA骨架磷酸基团与Gu+基团之间的多价盐桥与DNA放大器单体强烈结合。这种相互作用中和了DNA放大器单体的负电荷，并大幅提高了二硫键单体的局部浓度，从而加速开环二硫键交换聚合，形成自组装为稳定二硫键衍生DNA放大器纳米颗粒（GDANPs）的GD/DNA复合物。重要的是，通过利用巯基介导的细胞摄取机制，GDANPs可直接进入细胞质，同时完全避开内溶酶体捕获。此外，由于GD分子赋予的电荷中和和空间位阻效应，GDANPs表现出卓越的生体稳定性，使其能够在活体系统中可靠运行。一旦内化，GDANPs响应内源性谷胱甘肽（GSH）迅速发生细胞内解聚，从而释放P-HCR放大器用于miRNA检测。随后，内源性miR-21触发pH 1和pH 2之间的回文末端介导的交联HCR，驱动细胞内DNA网络的组装并产生放大的荧光读数。此外，Gu+基团与P-HCR探针之间的相互作用不仅中和了DNA的负电荷，还提供了空间位阻，从而保护探针免受复杂生物环境中的降解。综上所述，通过高效的非溶酶体细胞内递送，GDANPs在体内实现了细胞内miRNA成像的高灵敏度和特异性，优于脂质体等传统递送载体。因此，该自组装二硫键衍生DNA放大器纳米颗粒平台有望成为精准癌症诊断和高级生物医学分析的有价值工具。
章节摘要
GDANPs的设计与表征
在本研究中，选择回文末端介导的交联杂交链反应（P-HCR）作为DNA放大器，用于miRNA生物标志物的扩增检测。P-HCR是一种无酶自主扩增反应，具有灵敏度高和回文DNA构建模块设计灵活的特点。如图1A所示，P-HCR系统仅由两个回文DNA发夹探针（pH 1和pH 2）组成，详细序列见附表S1。由于回文片段的特性，
结论
总之，我们开发了一种自组装二硫键衍生DNA放大器纳米平台（GDANPs），能够实现P-HCR放大器的直接递送至胞质且不依赖内吞途径，从而进行高灵敏度和高特异性的miRNA成像。通过利用胍基（Gu+）基团与DNA磷酸骨架之间的多价盐桥，GD分子驱动开环二硫键交换聚合，生成稳定纳米颗粒，并利用巯基介导的摄取机制绕过内
试剂
所有寡核苷酸（表S1）均经高效液相色谱（HPLC）纯化，由上海生工生物科技股份有限公司提供。使用前，所有发夹探针在95 °C下加热5 min，然后在室温下逐渐冷却1 h，以确保这些发夹探针折叠成发夹结构。GelRed核酸染料、TBE缓冲液和Hoechst 33342购自上海生工生物科技股份有限公司。Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）由
CRediT作者贡献声明
李连石昌：可视化、调查研究。饶潘向：调查研究。王香悦：调查研究。李明熙：调查研究。林晓芳：调查研究。周洁：资源提供。卢春华：论文撰写–审阅与编辑、监督、方法论。邢超：论文撰写–审阅与编辑、项目管理、方法论。
利益冲突声明
作者声明他们不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究获得了福建省自然科学基金（编号：2024J011177）和发树基金项目（编号：MFK24030）的经费支持。
李连石昌|饶潘向|王香悦|李明熙|林晓芳|周洁|卢春华|邢超
