一种级联催化支架通过增强线粒体生物能量学和骨免疫调节重编程代谢生态位以促进骨修复

《Chemical Engineering Journal》：A cascade-catalytic scaffold reprograms metabolic niche to boost bone repair via enhanced mitochondrial bioenergetics and osteoimmunomodulation

　　

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  制备了一种集成级联催化功能的 3D 打印支架。
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  TGLC 支架可通过 LOx/CAT 级联催化重新编程骨骼中富含乳酸的微环境。
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  TGLC 支架促进乳酸至丙酮酸的通量以调节细胞能量代谢。
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  TGLC 支架增强了 BMSCs 的成骨作用并诱导巨噬细胞 M2 极化。
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  证明 TGLC 支架在兔子缺陷模型中能加速骨修复。

引言

骨缺损（由创伤性损伤、骨质疏松症、肿瘤切除等引起）每年影响数百万人，严重损害生活质量并带来重大的生命威胁风险 [1], [2], [3]。尽管自体移植、同种异体移植和异种移植仍然是临床骨缺损重建的金标准，但它们存在相当多的局限性，包括供体稀缺、免疫排斥和疾病传播风险 [4]。因此，合成骨替代品，特别是由生物活性陶瓷（如β-磷酸三钙 (β-TCP)、生物玻璃 (BG) 和羟基磷灰石 (HA)）制成的替代品，由于其可调的机械性能、可制造性和生物相容性，已成为有前景的替代方案 [5], [6]。随着骨组织工程的进步，生物陶瓷支架在骨修复中获得了显著地位，通过提供机械和结构支持，通过互连孔隙促进细胞迁移和组织生长，并释放生物活性离子（例如 SiO₄^4?、Ca²⁺、PO₄^3?、Mg²⁺ 等）来增强细胞行为，最终加速骨再生 [7], [8], [9]。然而，大多数目前的骨修复策略忽视了细胞代谢（例如干细胞、免疫细胞和其他功能细胞）与不同愈合阶段不断变化的微环境之间的关键相互作用。代谢重编程和代谢物动力学深刻影响细胞命运和组织再生结果，但其治疗潜力仍未得到充分探索 [10], [11], [12], [13]。因此，设计能够在骨生态位内积极调节细胞代谢的亲再生支架代表了一种有前景但尚未充分开发的促进骨修复的方法。

细胞代谢在维持骨生态位稳态和指导再生方面发挥着关键作用，特别是在初始炎症阶段，其中骨免疫相互作用决定了愈合进程 [14]。细胞代谢状态不仅决定能量可用性，还指导表型承诺 [15]。缺陷产生后，血管损伤和免疫细胞浸润导致营养物质和氧气 (O₂) 迅速耗竭，促使转向厌氧糖酵解 [11]。虽然这满足了紧迫的细胞能量需求，但导致微环境中乳酸有害积聚 [16]。过量的乳酸破坏了细胞内 NAD⁺/NADH 稳态，打破了氧化还原平衡，从而损害线粒体生物能量学（例如氧化磷酸化 (OXPHOS)、三羧酸 (TCA) 循环），并扰乱各种细胞类型的生理功能 [17]。具体而言，高乳酸水平通过代谢物感知通路过度刺激巨噬细胞中的促炎细胞因子分泌，阻碍必要的 M1 至 M2 表型转变，并破坏骨免疫平衡，从而阻碍干细胞招募、血管生成和成骨 [18], [19]。它还通过生物能量干预损害了骨间充质干细胞 (BMSCs) 的增殖和成骨分化，导致骨再生延迟 [20]。实际上，生理性新骨形成强烈依赖于线粒体生物能量学，其中丙酮酸作为前体进入 TCA 循环以维持能量供应和功能 [15]。研究表明，外源性丙酮酸补充可以通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶 (PDK) 来增强丙酮酸脱氢酶复合体 (PDHC) 活性，从而促进丙酮酸向乙酰辅酶 A (acetyl-CoA) 的转化并为 TCA 通量提供燃料 [21]。M2 巨噬细胞更依赖于 OXPHOS 过程 [22], [23]。因此，在骨微环境中提供额外的丙酮酸可以为代谢调节和促进骨形成提供必要的生物能量支持。基于此，调节炎症期间的代谢动力学——例如减少乳酸积聚和增加丙酮酸可用性——预计可以塑造一个有利于骨修复的支持性代谢微环境。

在生理条件下，乳酸和丙酮酸水平由乳酸脱氢酶 (LDH) 催化其可逆转化来调节，这种转化依赖于 NAD⁺/NADH [24]。相比之下，乳酸氧化酶 (LOx) 是一种源自微生物的酶，在不依赖任何辅因子和氧化还原条件的不可逆反应中将乳酸氧化为丙酮酸和过氧化氢 (H₂O₂) [25]。尽管 LOx 的使用在酶学上看似诱人，但单独应用可能会由于反应的氧化还原状态而加剧缺氧，并因 H₂O₂ 的积聚促进有害的氧化应激 [26]。然而，如果与过氧化氢酶 (CAT) 联用，这些缺点可以被消除：CAT 将 H₂O₂ 分解为 H₂O 和 O₂，从而防止有害的氧化应激并抑制 H₂O₂ 与丙酮酸之间的进一步反应。同时，提供的 O₂ 确保了 LOx 的充分活性 [17], [27], [28]。这种协同酶级联为骨微环境内连续减少乳酸和供应丙酮酸提供了一种高效且生物安全的策略。

在此，我们设计了一种级联酶支架 (TGLC)，催化重塑骨微环境中的代谢信号，以协调骨免疫和成骨过程，促进骨缺损修复 (图 1)。TGLC 是通过 3D 打印过程使用β-TCP 材料制成的生物陶瓷支架 (图 S1)，随后该支架被注入共负载了最佳比例 LOx/CAT 的甲基丙烯酰化明胶 (GelMA) 水凝胶。β-TCP 支架提供机械支持和骨传导性 [29]，而级联酶使持续催化活性成为可能，从而有效地将积聚的乳酸转化为丙酮酸。这种代谢重塑增强了 BMSCs 中线粒体 OXPHOS 和三磷酸腺苷 (ATP) 的产生，激活了 MAPK、cAMP 和 JAK-STAT 等信号通路，促进增殖和成骨分化。同时，它还驱动巨噬细胞向抗炎的 M2 表型极化，上调了 OXPHOS 过程、FoxO 和 cAMP 信号通路，从而培育了一个积极的骨免疫微环境，能够调节有利于成骨的炎症细胞因子分泌。在兔股骨髁缺损模型中，与β-TCP 组和空白组相比，TGLC 支架显著加速了新骨形成。这项工作提出了一种新颖的代谢生态位重编程策略，将酶催化与支架设计相结合，通过细胞代谢调节增强骨再生。

章节摘要

GelMA 水凝胶的合成与表征

甲基丙烯酰化明胶 (GelMA) 是通过将甲基丙烯酸酯基团并入明胶中来制备的，参考先前发表的工作。简而言之，使用 100 毫升去离子水溶解 10 克明胶，然后在磁力搅拌下逐滴加入 5 毫升甲基丙烯酸酐溶液，系统保持在 50°C 下 1.5 小时。反应完成后，在 3500 g 下离心溶液 3 分钟。收集上清液并稀释为五倍体积的

TGLC 支架的制备与表征

为了缓解急性炎症期间骨缺损处乳酸水平升高的问题，利用 LOx 催化乳酸在 O₂ 存在下氧化为丙酮酸和 H₂O₂。然而，该反应伴随着一个无法控制的副过程，其中丙酮酸和 H₂O₂ 可能会进一步反应形成乙酸盐、二氧化碳 (CO₂) 和 H₂O [30]。H₂O₂ 的积聚可导致组织中出现有害的氧化应激 [31], [32]。为了保存丙酮酸，这是一种重要的前体

结论

在本工作中，开发了一种功能化有 LOx/CAT 共固定 GelMA 水凝胶 (TGLC) 的 3D 打印β-TCP 支架，用于重塑骨缺损愈合早期炎症阶段以过量乳酸积聚为特征的恶劣代谢生态位。这种级联酶系统可以持续将乳酸转化为丙酮酸，从而减轻乳酸积聚引起的应激，同时为能量匮乏的细胞提供关键的代谢底物。这些变化

CRediT 作者贡献声明

王晓：写作 – 初稿，可视化，验证，项目管理，调查，概念化。陈家杰：写作 – 初稿，可视化，项目管理，调查，形式分析，概念化。蒋嘉林：资源，方法论，数据整理。黄吉敏：资源，方法论，数据整理。张欣欣：软件，资源，形式分析。姜嘉敏：软件，资源，形式分析。唐凯：软件，调查。雷

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文所报道的工作。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（编号 2023YFB3810200）、国家自然科学基金委员会（编号 32271393 和编号 32571551）、上海交通大学医学院生物材料与再生医学研究所合作项目（编号 2022LHA01）的支持。

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