**中文标题：** 百香果籽乙醇提取物与白皮杉醇缓解高血糖及氧化应激的多靶点互补作用——整合人源/非人源抗糖尿病酶、人中性粒细胞氧化爆发及斑马鱼胚胎高血糖模型的比较评价

《ACS Omega》：Evaluation of Passiflora edulis Seed Extract and Piceatannol in Attenuating Hyperglycemia and Oxidative Stress Using Human and Nonhuman Antidiabetic Enzymes, Human Neutrophil Oxidative Burst, and Embryonic Zebrafish Hyperglycemia Model

　　

百香果（*Passiflora edulis*）种子虽为白皮杉醇（piceatannol, PIC）等生物活性化合物的来源，却常作为农工业残余物被废弃。通过乙醇提取实现其资源化利用，不仅符合循环经济原则，也为研究与氧化应激、炎症及葡萄糖稳态受损相关的代谢紊乱的抗氧化、抗炎和抗糖尿病潜力提供了可能。因此，本研究通过体外和体内试验，包括人源和非人源模型以及胚胎期诱导的高血糖模型，比较了百香果籽乙醇提取物（*P. edulis* seed ethanol extract, PESE）与PIC的生物活性和毒理学特征。斑马鱼实验程序经动物使用伦理委员会（CEUA；批准号：13/2022）批准。液相色谱-质谱联用（LC–MS）鉴定出PIC为PESE的主要成分之一，该提取物表现出高总酚含量和显著的抗氧化能力。PIC在清除DPPH^•、HOCl和O₂^•–方面表现出比PESE更强的抗氧化效力。PIC还能抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，IC₅₀值分别为11.8和3.1 μg/mL，其中对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于阿卡波糖，并能激活葡萄糖激酶。相比之下，PESE抑制了PTP1B（IC₅₀ = 29.8 μg/mL），而单独使用PIC未观察到此效应。两种样品均能减少人中性粒细胞中活性氧（ROS）的产生，其中PIC在鲁米诺实验中表现出高效力（IC₅₀ = 0.12 μg/mL）。在斑马鱼胚胎中，PESE的胚胎毒性低于PIC，LC₅₀值分别为39.3和6.2 μg/mL。在高血糖斑马鱼模型中，两种样品均显著降低了总游离葡萄糖和氧化活性（p ≤ 0.05），并诱导了不同的抗氧化基因表达响应：PESE上调了*nfe2l2a*、*sod1*、*sod2*和*cat*，而PIC上调了*nfe2l2a*、*gpx1a*和*cat*。这些发现表明，PESE和PIC通过多种互补机制对抗高血糖和氧化应激，突显了这一未充分利用副产物的治疗潜力，同时强调了发育毒性评估对于植物源制剂安全推进的重要性。

**论文解读：百香果籽乙醇提取物与白皮杉醇的多层次抗高血糖及抗氧化活性比较研究**

**一、研究背景与立项依据**

持续性氧化应激已被认为是代谢失调——尤其是与胰岛素抵抗相关疾病——的核心机制。活性氧与活性氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）的过度生成及抗氧化防御系统受损会损害葡萄糖利用并维持氧化还原失衡，形成恶性循环，推动以糖尿病（diabetes mellitus, DM）为代表的慢性疾病进展。在临床实践中，胰岛素抵抗既表现于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM），也发生于妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）。尽管口服降糖药（用于T2DM）和胰岛素治疗（用于GDM）能有效控制血糖水平，但这些手段并不直接干预维持代谢功能障碍的氧化应激通路。这一局限推动了对天然产物作为补充治疗策略的日益关注，此类策略能够同时调节高血糖和氧化应激。在此背景下，农工业副产物作为可持续且尚未充分开发的生物活性植物化学物质来源而备受重视，将治疗创新与循环经济原则相结合。百香果（*Passiflora edulis*）在巴西及其他热带地区广泛种植，其种子常被视为低价值副产物而丢弃，但事实上它们富含白皮杉醇（piceatannol, PIC）——一种具有邻苯二酚（catechol）取代结构的芪类化合物——以及其他酚类活性物质。尽管已有若干研究涉及百香果籽和PIC的生物活性，但本研究首次对粗提物（PESE）与分离纯化的PIC进行了直接比较评价，采用了一种全面、多层次的研究策略，整合了人源与非人源抗糖尿病酶（包括葡萄糖激酶激活和PTP1B抑制）、人中性粒细胞氧化爆发实验以及胚胎斑马鱼高血糖模型与Nrf2调控抗氧化基因表达分析。这种整合策略可以对提取物与纯化合物的差异特征、多靶点潜力及安全性进行更为稳健的评估。

**二、研究目的与总体设计**

研究人员旨在对PESE与分离纯化的PIC进行比较实验评价，采用互补的体外和胚胎体内模型。研究使用了人源和非人源抗糖尿病酶——猪胰腺α-淀粉酶和酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）α-葡萄糖苷酶作为两种广泛使用的非人源酶用于初步抗糖尿病筛选，因其具有高重复性、低成本且与人源酶反应有良好相关性；人源酶葡萄糖激酶（glucokinase, GK）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B）则提供更接近人体生理的转化相关性——人中性粒细胞氧化爆发细胞实验，以及胚胎斑马鱼高血糖模型作为整合的体内脊椎动物系统，用于评估对血糖、氧化应激和抗氧化基因表达的系统性效应。该研究在直接比较化学复杂的种子提取物与分离纯化PIC方面提供了独特贡献，能够识别优先与PIC相关的活性以及仅在完整提取物中观察到的效应，从而为其差异性和潜在互补的抗氧化与抗糖尿病特征提供新证据。

**三、关键技术方法概述**

PESE的制备采用索氏提取法：干燥种子经正己烷脱脂后，以无水乙醇连续提取6小时，旋蒸浓缩至恒重（得率12.3 ± 1.5%）。化学成分通过液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS，Orbitrap QE）在正负电喷雾离子化模式下进行表征，代谢物鉴定基于高分辨MS/MS碎裂谱与文献数据比对。抗氧化活性通过DPPH^•清除实验、HOCl清除实验（荧光法，DHR-123探针）和超氧阴离子自由基（O₂^•–）清除实验评估，总酚含量（total phenolic content, TPC）采用Folin–Ciocalteu法测定。抗糖尿病酶活性评价包括：猪胰腺α-淀粉酶抑制实验（底物CNPG3）、酿酒酵母α-葡萄糖苷酶抑制实验（底物PNPG）、人重组PTP1B抑制实验（底物pNPP）以及人GK激活实验（商业试剂盒，荧光检测）。人中性粒细胞由健康供体外周血经密度梯度离心分离（伦理委员会批准），氧化爆发通过PMA刺激后以鲁米诺（luminol）化学发光法和APF荧光法监测。斑马鱼（*Danio rerio*，AB品系）胚胎毒性按OECD第236号指南（FET测试）评估，计算LC₅₀。高血糖模型采用葡萄糖（2% w/v）从3 hpf持续或脉冲式暴露至96 hpf，总游离葡萄糖以便携式血糖仪定量，ROS以H₂DCFDA探针检测，抗氧化基因表达（*sod1*、*sod2*、*cat*、*gpx1a*、*gsr*、*nfe2l2a*）以qPCR分析（2^?ΔΔCt法，*actb*为内参基因）。动物实验获巴西阿拉戈斯联邦大学CEUA批准（批准号：13/2022），植物材料获取已登记于巴西SisGen系统（代码：A1CA908），样本来源于巴西阿拉戈斯州Matriz do Camaragibe的有机百香果农场（Fazenda Paraíso Agrícola）。

**四、主要研究结果**

**4.1 提取与化学成分分析（Extraction and Chemical Profiling of PESE）**
LC-HRMS在负离子ESI模式下鉴定出PESE中三种主要酚类化合物：PIC（*m/z* 243.071，质量误差1.7 ppm）、scirpusin B（*m/z* 485.121，质量误差1.2 ppm，为PIC二聚体）和柚皮素（naringenin，*m/z* 271.061，质量误差2.4 ppm），所有质量误差均<5 ppm，确认为高置信度鉴定。

**4.2 总酚含量与抗氧化能力（TPC and Antioxidant Capacity）**
PESE的TPC为238.9 ± 1.9 mg GAE/g干提取物，证实百香果籽为酚类丰富基质。在DPPH^•、HOCl和O₂^•–清除实验中，PESE和PIC均表现出显著抗氧化活性（p ≤ 0.05）。PIC的效力始终高于PESE：DPPH^•实验中约3.7倍（IC₅₀：3.9 vs 14.5 μg/mL），HOCl实验中约10.7倍（IC₅₀：0.5 vs 5.4 μg/mL），O₂^•–实验中约1.7倍（IC₅₀：8.3 vs 13.9 μg/mL）。两种样品对HOCl的清除效果最佳。

**4.3 葡萄糖代谢酶的调节作用（Modulation of Glucose Metabolism Enzymes）**
PIC抑制了猪胰腺α-淀粉酶和酿酒酵母α-葡萄糖苷酶，IC₅₀值分别为11.8 ± 0.5 μg/mL（48.2 μM）和3.1 ± 0.1 μg/mL（12.6 μM），均显著低于PESE（47.9 ± 2.9和16.1 ± 1.0 μg/mL；p ≤ 0.05）。值得注意的是，PIC对α-葡萄糖苷酶的抑制远强于阳性对照阿卡波糖（IC₅₀ = 153.4 ± 3.1 μg/mL），但对α-淀粉酶的抑制弱于阿卡波糖（IC₅₀ = 1.0 ± 0.1 μg/mL）。在人源PTP1B实验中，PESE表现出抑制作用（IC₅₀ = 29.8 ± 2.7 μg/mL），而PIC在高达2.5 μg/mL时仍无活性，提示PESE中其他成分（如scirpusin B和柚皮素）可能负责PTP1B抑制效应。两种样品均激活GK，PIC的激活效力显著高于PESE（IC₅₀：0.4 ± 0.0 vs 11.6 ± 1.6 μg/mL），但均弱于阳性对照多扎格列汀（dorzagliatin，IC₅₀ = 0.1 ± 0.0 μg/mL）。据研究人员所知，这是首次直接评价PIC和PESE对GK活性的影响。

**4.4 人中性粒细胞氧化爆发的抑制（Inhibition of Human Neutrophils' Oxidative Burst）**
在PMA诱导的人中性粒细胞氧化爆发实验中，两种样品均表现出抑制作用。鲁米诺实验中，PIC的IC₅₀最低（0.1 ± 0.0 μg/mL；0.5 μM），显著优于PESE（2.0 ± 0.1 μg/mL；p ≤ 0.05）及NADPH氧化酶抑制剂VAS2870（0.5 ± 0.0 μg/mL）。在APF实验中，PIC的IC₅₀（0.4 ± 0.0 μg/mL）约为PESE（2.7 ± 1.2 μg/mL）的七分之一，且两种样品均显著优于MPO抑制剂ABAH（4.0 ± 0.4 μg/mL；p ≤ 0.05）。

**4.5 斑马鱼胚胎毒性与亚致死效应（Embryotoxicity and Sublethal Effects in *Danio rerio*）**
PESE的LC₅₀为39.3 μg/mL，而PIC的LC₅₀仅为6.2 μg/mL（25.4 μM），表明PIC在实验条件下具有更高的胚胎毒性。在亚致死浓度（LC₅₀的1/10和1/20）下，PESE（4.0和2.0 μg/mL）暴露的胚胎存活率始终高于90%，且发育异常极少，仅2.0 μg/mL时观察到轻微心包水肿。相比之下，PIC在0.6 μg/mL（2.5 μM）时存活率降至约80%，且两种浓度（0.3和0.6 μg/mL）均诱发心包水肿和卵黄囊不吸收等畸形。

**4.6 高血糖斑马鱼胚胎中的葡萄糖调节（Glucose Modulation in Hyperglycemic Zebrafish Embryos）**
在脉冲式高血糖模型（模拟妊娠期糖尿病的血糖波动）中，PESE和PIC各浓度均显著降低葡萄糖水平（p < 0.001），PIC在72 hpf呈剂量依赖性效应。在正常血糖间期（48和96 hpf），PESE和PIC的最低浓度将葡萄糖恢复至与对照组相当的水平。在持续高血糖模型中，葡萄糖从24 hpf起持续升高（p < 0.001）。PESE（4.0 μg/mL）从24 hpf起减弱高血糖，PIC两种浓度均有效（p ≤ 0.05）。虽然所有处理均显著降低葡萄糖（p ≤ 0.05），但胰岛素（0.1 U/mL）仍更为有效（p ≤ 0.05）。双因素方差分析显示处理-时间交互作用显著（p < 0.01）。

**4.7 斑马鱼胚胎中的氧化应激与抗氧化基因表达（Oxidative Stress and Antioxidant Gene Expression）**
持续暴露于葡萄糖使斑马鱼幼鱼ROS水平升高近3倍（p ≤ 0.05）。PESE（4.0和2.0 μg/mL）和PIC（0.6和0.3 μg/mL）均显著减弱葡萄糖诱导的ROS生成（p ≤ 0.05）。在基因表达层面，高血糖显著改变了抗氧化基因的表达谱——*sod2*、*gpx1a*和*nfe2l2a*上调，而*sod1*和*cat*下调（p ≤ 0.05），*gsr*无显著变化。PESE显著上调*nfe2l2a*（2.0 μg/mL时约5倍）、*sod1*、*sod2*和*cat*（p ≤ 0.05），表明其协调激活了超氧化物歧化与过氧化氢清除通路。PIC则显著上调*nfe2l2a*（0.3 μg/mL时约4倍）、*gpx1a*和*cat*（p ≤ 0.05），提示其优先调控谷胱甘肽和过氧化物酶依赖的抗氧化机制。总体而言，PESE 2.0 μg/mL和PIC 0.3 μg/mL引发了最为强烈的Nrf2通路激活及下游抗氧化基因协调调控。

**五、讨论总结与研究结论**

本研究证明，百香果籽乙醇提取物（PESE）和分离纯化的白皮杉醇（PIC）在化学、酶学、细胞和胚胎斑马鱼模型中表现出既有区别又互为补充的抗氧化与抗糖尿病特征。PIC在多项抗氧化实验、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制、葡萄糖激酶调节以及人中性粒细胞氧化爆发抑制方面展现出更强的效力；而PESE则展现出更广泛的多靶点活性，包括PTP1B抑制，提示提取物中其他成分可能贡献了其部分生物效应。两种样品均能减弱高血糖相关的氧化产物生成并调节斑马鱼胚胎的抗氧化基因表达。然而，毒理学结果显示PESE的胚胎安全性优于PIC，凸显了剂量选择和全面安全性评估的重要性。总体而言，完整提取物与纯化合物之间的直接比较提供了新证据，表明PESE的生物活性不能仅归因于白皮杉醇。这些发现支持百香果籽作为多功能生物活性化合物可持续来源的潜力，同时强调了在考虑转化应用或营养制剂开发之前，必须进行化学标准化、定量表征、药代动力学研究以及哺乳动物模型中的功效与安全性评价。