《ACS Omega》：A CS?CBE System Targeting β-Catenin: Exploring Additional Inhibition Targets for Colon Cancer Proliferation
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结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，因此寻找新的治疗靶点研究工具已成为当务之急。本研究利用壳聚糖（chitosan）和胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）构建了一种CS•CBE整合递送与编辑系统，该系统能够成功
结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，因此寻找新的治疗靶点研究工具已成为当务之急。本研究利用壳聚糖（chitosan）和胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）构建了一种CS•CBE整合递送与编辑系统，该系统能够成功靶向并抑制β-catenin的磷酸化。体外研究表明，该系统在HCT116细胞中实现了86.0%的高递送效率和78%的编辑效率，Transwell和伤口愈合实验证实CBE-β-catenin-HCT116细胞表现出增强的增殖速率。此外，研究人员在裸鼠中建立了异种移植瘤模型，观察到实验组的肿瘤体积和重量均显著高于对照组。随后，从转录组结果中鉴定出的候选基因，如β-catenin通路下游的AXIN2和GPR15，验证了CS•CBE系统作为研究工具的可行性。总之，该CS•CBE系统可作为结肠癌研究中靶向蛋白调控、下游靶点鉴定以及特异性翻译后修饰分析的有价值研究工具。
**研究背景与问题**
结肠癌是全球第三大常见癌症，发病率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为恶性肿瘤相关死亡的重要原因。目前，结肠癌的治疗手段主要包括手术切除、化疗和靶向治疗，常用靶向药物有贝伐珠单抗（bevacizumab）和西妥昔单抗（cetuximab）。然而，多数靶向药物并不适用于所有患者，因此亟需发现新的靶向位点，为靶向药物治疗提供更多可能性。
β-catenin是一种多功能致癌基因，调控细胞增殖、分化和凋亡。生理条件下，β-catenin在Ser33位点发生磷酸化后被降解；抑制该位点的磷酸化可导致β-catenin异常积累，进而促进结肠肿瘤发生。因此，靶向修饰Ser33残基是推进结肠癌研究的关键切入点。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）是一种精确的基因编辑技术，通过介导DNA序列中胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的靶向转换实现单碱基替换，且不诱导DNA双链断裂（DSBs），可显著减少错误修复事件。然而，CBE的递送效率是限制其应用的关键因素。传统电穿孔法会损害细胞活力，病毒载体存在生物安全隐患，脂质体递送效率欠佳。壳聚糖（chitosan, CS）作为一种天然产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其阳离子特性可与带负电的核酸形成稳定复合物，是安全的替代递送载体。
**研究目的与结论**
基于上述背景，研究人员构建了由壳聚糖和胞嘧啶碱基编辑器组成的整合递送与编辑系统（命名为CS•CBE系统），用于介导β-catenin的靶向修饰。该系统在体外（HCT116细胞）中成功实现高效递送和编辑，并通过体内裸鼠成瘤实验验证了β-catenin异常积累对肿瘤增殖的促进作用。通过转录组分析，研究人员鉴定出AXIN2和GPR15两个与结肠癌增殖相关的潜在靶点，验证了CS•CBE系统作为研究工具的可行性，为结肠癌的靶向蛋白调控、下游靶点鉴定和翻译后修饰分析提供了新工具。
**主要技术方法**
研究人员使用离子交联法制备壳聚糖-质粒纳米颗粒，通过动态光散射（DLS）和扫描电子显微镜（SEM）表征其粒径、多分散指数（PDI）和形态。将β-catenin-CBE质粒和β-catenin-sgRNA-mCherry质粒以不同比例包封于不同浓度壳聚糖溶液中，确定最佳递送条件。以人结肠癌细胞系HCT116和SW480为体外模型（均获自美国典型培养物保藏中心，后由安徽大学干细胞与转化医学研究中心提供），通过流式细胞术检测mCherry荧光评估递送效率，通过PCR扩增和Sanger测序评估编辑效率。采用CCK-8实验检测细胞活力，伤口愈合实验和Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。在体内实验中，将CBE-β-catenin-HCT116细胞接种于5周龄雄性裸鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）腋下建立异种移植瘤模型，通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）染色观察肿瘤组织学特征，并通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，筛选差异表达基因（DEGs）并进行GO和KEGG通路富集分析。
**研究结果**
**3.1 壳聚糖的合成与表征**
通过扫描电子显微镜观察到，不同浓度壳聚糖包封形成的纳米颗粒呈球形形态。动态光散射测量显示，颗粒大小随壳聚糖浓度变化，尺寸均接近100 nm，ζ电位约为2 mV。当壳聚糖浓度达到0.2和0.3 mg/mL时，纳米颗粒表现出较高的多分散指数（PDI=0.4377），表明过高浓度易诱导纳米颗粒聚集；而0.1 mg/mL浓度时递送效率较低（44.1%）。因此，后续实验选择0.2 mg/mL壳聚糖进行DNA包封。
**3.2 壳聚糖在递送和编辑效率上优于脂质体**
通过优化质粒剂量，研究发现2 μg β-catenin-sgRNA-mCherry质粒与1.5 μg β-catenin-CBE质粒的组合产生最强荧光强度和最高递送效率（81.9%）。与脂质体递送相比，壳聚糖递送在HCT116细胞中实现86.0%的递送效率，显著高于脂质体的66.7%；在SW480细胞中同样如此（73.2%对60.9%）。Sanger测序结果显示，壳聚糖介导的C-to-T突变率在HCT116和SW480细胞中分别达到78%和82%，显著高于脂质体组的42%和56%。CCK-8实验表明，壳聚糖转染对细胞活性的抑制作用短暂，约60 h后细胞活性恢复正常。
**3.3 壳聚糖递送不影响细胞活力并促进细胞迁移和侵袭**
通过有限稀释法筛选出编辑效率为100%的单克隆细胞系CBE-β-catenin-HCT116。CCK-8实验显示，与对照组相比，实验组OD值仅有轻微非显著降低（P>0.05），证明壳聚糖介导的转染对细胞活力影响可忽略。伤口愈合实验中，实验组的划痕愈合率显著高于对照组；Transwell实验中，实验组迁移细胞数明显多于对照组。转录组测序散点图显示两组间存在显著转录差异。结果表明，CS•CBE系统递送β-catenin质粒对HCT116细胞活力无显著影响，但增强了细胞增殖和迁移能力。
**3.4 裸鼠荷瘤模型的构建**
将CBE-β-catenin-HCT116细胞皮下接种裸鼠后10天，剥离肿瘤并测量。结果显示，实验组肿瘤体积和重量均显著高于对照组。H&E染色观察发现，实验组染色更深、细胞核分布不规则；免疫组化染色显示实验组KI67表达增加，表明β-catenin过度积累导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活，肿瘤增殖速率加快。
**3.4.2 RNA测序揭示两个潜在靶点**
通过RNA测序共筛选出7024个差异表达基因（|log2 Fold Change|≥1，p<0.05），其中表达上调的前列基因包括AXIN2、SPTSSB、ZNF704、TMEM98、GPR15等，下调基因包括STC2、CD44、HILPDA等。GO富集分析显示DEGs主要注释到细胞增殖、多细胞生物发育、质膜成分和细胞-细胞黏附等条目；KEGG通路富集分析显示DEGs显著富集于NF-κB信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路和IL-17信号通路。其中，AXIN2是Wnt/β-catenin信号通路的关键调控因子，与结肠癌进展密切相关，可作为监测结肠癌进展和预后的潜在生物标志物及靶点；GPR15作为定位在质膜上的G蛋白偶联受体（GPCR），可能通过配体结合介导炎症反应和细胞迁移，其上调可能与肿瘤免疫逃逸和肿瘤微环境重塑有关。
**讨论与结论**
研究首先确定了最佳壳聚糖浓度和质粒剂量，证明壳聚糖的递送效率和编辑效率均优于脂质体，并验证了其生物安全性。CS•CBE系统结合CBE不产生DSB的优势，显著降低了脱靶事件和插入缺失突变，适合进行蛋白质翻译后修饰相关氨基酸位点的精细定位。体内编辑结果结合生物信息学分析鉴定出AXIN2和GPR15两个增殖相关靶基因，进一步验证了CS•CBE系统作为研究工具的可行性。总之，该策略为结肠癌的治疗探索提供了新见解：CS•CBE整合递送与编辑系统能够高效、精准地修饰β-catenin的Ser33位点，通过分析裸鼠肿瘤中的编辑细胞，可阐明与结肠肿瘤发生相关的靶位点，为结肠癌研究提供新的研究工具。
