利用miniTurbo邻近标记鉴定Neuro-2a细胞中与神经元发育相关的Gβ5相互作用组

《ACS Omega》：Identification of Gβ5 Interactome Associated with Neuronal Development in Neuro-2a Cells through miniTurbo Proximity Labeling

　　

Gβ5是Gβ家族的成员；然而，与其他异三聚体Gβ蛋白响应G蛋白偶联受体（GPCR）激活而转导细胞外信号不同，Gβ5通过稳定GTP酶激活蛋白（GAP）——即G蛋白信号调节因子（RGS）R7亚家族（R7-RGS）——来负性调节GPCR信号转导。Gβ5的突变与一种多系统发育障碍有关。尽管质膜上的GPCR信号调节在此过程中可能很重要，但Gβ5/R7-RGS也定位于细胞质和细胞核。Gβ5在这些亚细胞分区中的潜在蛋白质-蛋白质相互作用尚未得到充分研究，因此研究人员试图利用Neuro-2a细胞中的活细胞生物素邻近标记实验结合质谱法，表征Gβ5的相互作用组，以鉴定该复合物的新型蛋白质相互作用。通过两种分析方法，研究人员鉴定了48个Gβ5的潜在相互作用因子，其中大多数是先前未报道的、在神经元发育和功能中重要的相互作用。研究人员结果中与Gβ5相互作用组相关的富集表型与先前报道的Gβ5缺陷表型一致。

Gβ5是Gβ蛋白家族的成员，但与经典异三聚体Gβ蛋白介导G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导不同，Gβ5通过稳定G蛋白信号调节因子R7亚家族（R7-RGS）这类GTP酶激活蛋白（GAP），负性调节GPCR信号。小鼠中Gβ5双等位基因敲除导致断奶前高死亡率、发育迟缓、低体重及脑发育受损；人类GNB5基因突变则与智力发育障碍伴心律失常（IDDCA）相关，表现为认知障碍、癫痫、肌张力低下和窦性心动过缓等症状。既往研究多聚焦于质膜上Gβ5/R7-RGS复合物的GAP功能，但该复合物同样定位于细胞质和细胞核，这些亚细胞区室中的蛋白质-蛋白质相互作用尚不清楚。为系统鉴定Gβ5在活细胞中的潜在互作蛋白，研究人员利用基于生物素连接酶的邻近标记技术，在Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤细胞中开展了Gβ5相互作用组研究。

研究人员构建了miniTurbo-Gβ5融合蛋白，并以miniTurbo单独表达作为对照，在Neuro-2a细胞中稳定表达后，结合链霉亲和素富集与质谱分析，通过数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA）两种方法共鉴定出48个高置信度潜在相互作用因子。生物信息学分析显示，这些蛋白显著富集于神经及机体发育相关通路，与已知Gβ5缺陷表型一致。随后，研究人员通过免疫共沉淀（Co-IP）验证了ALADIN、ACAT2、EPS15L1和RPTOR与Gβ5的相互作用。该研究为理解Gβ5在细胞质和细胞核中的新功能提供了重要基础。

主要关键技术方法如下：使用购自VectorBuilder的miniTurbo-Gβ5和miniTurbo慢病毒载体转导Neuro-2a细胞（ATCC CCL-131），经杀稻瘟菌素筛选建立稳定细胞系N2A-mTGβ5和N2A-mT；以50 μM生物素处理30分钟进行活细胞邻近标记，链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白；经S-Trap酶解后分别采用Orbitrap Exploris 480（DDA模式）和Orbitrap Fusion Lumos（DIA模式）质谱分析；数据分别用Proteome Discoverer 3.0和DIA-NN 1.9检索；通过STRING数据库构建蛋白互作网络，并使用QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行疾病与功能富集分析；采用anti-HA磁珠进行Co-IP验证。

结果如下。

验证miniTurbo-Gβ5融合蛋白：Co-IP实验表明，miniTurbo-Gβ5能与外源表达RGS7结合，而miniTurbo单独不能；亚细胞分级显示miniTurbo-Gβ5与内源性Gβ5及RGS7一致地分布于细胞质、膜和核组分；生物素时间梯度实验显示其具有活性生物素连接酶功能，并观察到约55 kDa的RGS7生物素化条带。

网络和通路分析：DDA共鉴定2625种蛋白，其中24个符合高置信度标准（变化倍数≥5，p≤0.05）；DIA共鉴定6744种蛋白，高置信度24个。STRING分析显示DDA网络PPI富集p值<10^?16（183个蛋白），DIA网络p值为8.21×10^?16（113个蛋白），均显著富集已知蛋白互作。IPA分析显示高置信度蛋白主要定位在细胞质、细胞核和质膜，并富集于细胞组装与组织、细胞形态、神经系统发育与功能以及机体发育等疾病与功能类别。

验证性Co-IP：研究人员从DDA结果中选取代表不同亚细胞定位的ALADIN（核）、ACAT2（其他）、EPS15L1（质膜）和RPTOR（细胞质）进行验证。以3xFLAG-RGS7为阳性对照，以缺失DEP/DHEX和GGL结构域的RGS7突变体（ΔΔ-RGS7）及不共表达Gβ5为阴性对照。结果显示ALADIN、ACAT2和RPTOR与3xHA-Gβ5强共沉淀，EPS15L1呈弱信号，表明邻近标记结果与直接物理相互作用具有一致性。

讨论部分指出，DDA与DIA数据集重叠较少，源于两种采集模式内在差异；miniTurbo在核中表达较弱可能影响核内互作鉴定。RGS7虽在质谱中丰度很高，但因部分重复中非特异性标记降低了统计显著性，提示其他潜在互作因子可能未被完整捕获。候选蛋白中，ALADIN是核孔复合体胞质侧WD40重复蛋白，其突变导致Triple-A综合征，症状与IDDCA存在重叠（肌张力低下、智力障碍、视神经萎缩）；ACAT2参与胆固醇酯合成，可能与Gβ5/R7相关的肝脏炎症有关，但机制尚不明确；EPS15L1是网格蛋白包被坑的组成蛋白，其敲除小鼠表现出新生儿死亡率高、体重低、突触囊泡减少等，与Gβ5敲除表型部分相似；RPTOR是mTORC₁支架蛋白，影响多种组织发育及神经元功能。这些重叠表型提示相互作用可能具有病理生理意义。

结论：通过miniTurbo邻近标记，研究人员在多个亚细胞区室中鉴定出48个Gβ5推定互作蛋白。该Gβ5相互作用组富集了神经系统和机体发育相关蛋白，与Gβ5已知功能高度一致。通过Co-IP验证的四个蛋白中，三个与Gβ5缺陷存在病理表型重叠。该研究为解析Gβ5及R7-RGS蛋白在细胞质和细胞核中的生物学功能奠定了坚实基础。