三维电子衍射解析SARS-CoV-2 3CLpro 1,3,5-三嗪-2,4-二酮肉桂酰胺共价抑制剂的原子级晶体结构

《ACS Omega》：3D Electron Diffraction Elucidates the Structure of a 1,3,5-Triazin-2,4-dione Cinnamamide Covalent Inhibitor of SARS-CoV-2 3CLpro

　　

冠状病毒3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，3CL^pro）是抗冠状病毒药物发现的关键靶点。研究人员合成并评价了11个含有靶向Cys145的α,β-不饱和迈克尔受体（Michael acceptor）的1,3,5-三嗪-2,4-二酮肉桂酰胺类共价化合物（1a–1k）对SARS-CoV-2 3CL^pro的抑制活性。化合物1a显示出最高的抑制效力（IC₅₀ = 92.45 nM），并通过结构和对接分析进行了进一步表征。为确定其晶体结构，研究人员应用了三维电子衍射（three-dimensional electron diffraction，3DED），该方法能够在超低剂量条件下实现纳米晶体的原子级分辨率分析。三个数据集的整合将完整度从58.2%提升至91.0%，获得了分辨率为0.85 ?的精修结构模型。所得结构提供了化合物1a分子构象和固态堆积的实验性模型，并阐明了α,β-不饱和肉桂酰胺片段在晶体状态下的几何构型。共价对接分析进一步表明，肉桂酰胺迈克尔受体能够在3CL^pro活性位点内朝向Cys145采取合理的结合取向。该工作突显了3DED作为辐照敏感的药物纳米晶体结构分析的有用方法，并为含肉桂酰胺的3CL^pro抑制剂的进一步优化提供了实验性结构信息。

**论文解读**

**一、研究背景与意义**

自2020年初爆发以来，由SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型）引起的COVID-19已对全球造成持续性负担。截至2026年3月，全球累计确诊病例已超过8.03亿，报告死亡人数超过710万。尽管世界卫生组织已宣布COVID-19不再构成国际关注的突发公共卫生事件，但SARS-CoV-2仍在持续传播并产生具有改变传播性和免疫逃逸特性的变异株，使得有效的抗病毒治疗药物与疫苗接种同样具有持续需求。冠状病毒3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CL^pro，又称M^pro）是一种半胱氨酸蛋白酶，负责在11个位点切割pp1a和pp1ab多聚蛋白以释放病毒复制和转录所需的非结构蛋白NSP4–NSP16。3CL^pro的序列和三维结构在多种冠状病毒中高度保守，使其成为一个具有广谱适用性的药物靶标。因此，抑制3CL^pro可阻断多聚蛋白加工并抑制病毒RNA复制和转录，从而限制病毒增殖。

近年来，药物化学已证实SARS-CoV-2 3CL^pro抑制的临床可行性。拟肽类共价抑制剂奈玛特韦（nirmatrelvir，PF-07321332）和非肽类非共价抑制剂恩昔特韦（ensitrelvir，S-217622）即体现了该靶标的治疗潜力。然而，这些药物也揭示了持续优化需求，包括改善代谢稳定性和口服暴露量、降低药物-药物相互作用风险以及在病毒演化过程中维持抗病毒效力。鉴于3CL^pro催化活性依赖于亲核性Cys145，当亲电试剂反应性得到适当调控时，共价抑制仍是实现高效力和持续靶标占有的有吸引力策略。在拟肽类共价设计之外，含亲电基团的非肽类共价化学型代表了有前景的优化起点。在此背景下，α,β-不饱和酰胺是可调控的迈克尔受体（Michael acceptor）弹头，其亲电性和空间性质可通过芳基取代进行调节。基于此，研究人员设计并合成了一系列带有不同芳基取代基的1,3,5-三嗪-2,4-二酮肉桂酰胺衍生物（1a–1k），将α,β-不饱和酰胺定位于Cys145的共价结合方向。构效关系（structure–activity relationship，SAR）分析确定未取代类似物1a为效力最强的抑制剂，因此选择其进行原子级分辨率的结构分析。

**二、研究目的与总体结论**

本研究旨在通过三维电子衍射（3DED）技术确定化合物1a的固态结构，以明确其分子构象、官能团取向和迈克尔受体几何构型，并将实验结构数据与酶学抑制和对接分析整合，为基于结构的进一步优化提供信息。研究结果表明，3DED成功实现了对传统单晶X射线衍射（SCXRD）无法解析的纳米晶体的原子级结构测定；通过多数据集合并策略克服了倒易空间覆盖不足的限制，获得了高完整度的亚埃级分辨率结构。解析所得晶体结构定义了肉桂酰胺骨架的固态分子构象，为理解其亲电体几何特征及与3CL^pro催化残基Cys145的潜在共价结合提供了结构基础。

**三、主要关键技术方法**

化合物1a形成纳米至亚微米级晶体，无法使用传统SCXRD。研究人员采用连续旋转电子衍射（continuous-rotation electron diffraction，cRED）方案，在JEOL F200透射电子显微镜上以200 keV加速电压收集数据，使用ASI Cheetah M3混合像素检测器，单帧曝光时间0.5秒，每个数据集总采集时间少于3分钟，有效减少了电子束对辐照敏感有机晶体的损伤。三个独立cRED数据集分别用XDS进行指标化和积分，随后用XSCALE进行缩放和合并，通过共同反射强度相关系数评估数据集间的同晶性后，将完整度从单一数据集的58.2%–68.4%提升至合并后的91.0%。结构采用SHELX程序套件中的直接法解析，并用SHELXL以电子散射因子进行精修。共价对接分析以AutoDockFR进行，受体模型采用SARS-CoV-2 3CL^pro晶体结构（PDB ID: 7VU6）。酶学抑制活性评价采用基于荧光共振能量转移（FRET）的商业试剂盒，以PF-07321332和S-217622为参比抑制剂，在A549、HEK293和HepG2三种细胞系中采用CCK-8法测定细胞毒性。

**四、研究结果**

**（1）合成与化学表征**

研究人员以Shionogi公司的非肽类非共价抑制剂S-217622以及研究团队此前报道的三嗪-2,4-二酮类抑制剂为先导化学型，通过N-酰化在1,2,3-三唑片段上引入不同芳基取代的肉桂酰基，得到含α,β-不饱和酰胺弹头的目标化合物1a–1k。所有类似物保持了相同的三嗪烷-二酮-三唑核心，仅在肉桂酰基苯环取代上存在差异，可直接评估电子效应和空间效应对共价抑制的影响。合成路线从3-叔丁基-6-(乙硫基)-1,3,5-三嗪-2,4(1H,3H)-二酮出发，经N-烷基化、三氟乙酸脱保护、N-炔丙基化、与6-氯-2-甲基-2H-吲唑-5-胺反应生成炔烃中间体后，以CuSO₄/抗坏血酸钠催化的叠氮-炔烃环加成构建三唑，再与各种肉桂酰氯偶联得到终产物。所有化合物均经¹H和¹³C核磁共振波谱和高分辨质谱进行表征。

**（2）SARS-CoV-2 3CL^pro抑制活性与细胞毒性**

化合物1a–1k对野生型SARS-CoV-2 3CL^pro的抑制活性通过FRET酶学试验进行评价，以共价抑制剂PF-07321332（IC₅₀ = 37.25 nM）和非共价抑制剂S-217622（IC₅₀ = 31.93 nM）为参比。未取代类似物1a是效力最强的化合物，IC₅₀为92.45 nM。肉桂酰基苯环上的取代普遍降低效力：间位取代耐受性最好，1b（3-CN，139.06 nM）、1c（3-NO₂，161.75 nM）、1e（3-CF₃，207.58 nM）和1f（3-F，276.19 nM）保持亚微摩尔活性；区域异构体1e（3-CF₃，207.58 nM）与1g（4-CF₃，371.83 nM）的比较进一步表明对间位取代的偏好。邻位取代显著削弱活性：1d（2-F）的IC₅₀超过1000 nM，1k（2-F,3-Br）仅显示弱抑制（IC₅₀ = 893.70 nM）。多重或空间位阻大的取代基同样不利，如1h（3,4-二F，482.69 nM）和1i [3,5-双(CF₃)，736.12 nM]。总体而言，SAR表明未取代肉桂酰胺1a最优，间位取代可适度耐受，而邻位或广泛取代显著降低效力。化合物1a在A549、HEK293和HepG2细胞中于最高测试浓度400 nM下细胞活力均保持在80%以上，估算CC₅₀值分别为3.24 mM、229 μM和1.17 μM，在测试浓度范围内未观察到明显细胞毒性。

**（3）3DED数据收集与结构解析**

化合物1a仅以纳米至亚微米级晶体形式结晶，传统SCXRD不适用。采用cRED方案以0.5秒每帧的超短曝光时间收集数据，每个完整cRED数据集在3分钟内采集完毕，最大分辨率为0.85 ?。数据在单斜晶系空间群Pc（第7号）中指标化，晶胞参数为a = 12.568 ?、b = 16.682 ?、c = 6.864 ?、β = 96.01°。经XSCALE合并后，三个数据集共同反射强度相关系数在0.899至0.918之间，表明数据来源于同一晶相并具有可兼容的缩放行为，合并后完整度达到91.0%，合并分辨率为0.87 ?。结构模型精修收敛至R1 = 0.280和wR2 = 0.5075，键长键角化学合理。3DED结构揭示化合物1a在固态中采取整体伸展的分子构象，肉桂酰胺片段呈现基本平面且伸展的几何形态。

**（4）数据完整度、数据集合并与精修策略**

三个独立cRED数据集在相似采集条件下从不同纳米晶体收集，均在相同单斜空间群Pc中指标化，晶胞参数高度一致，表明所分析晶体间存在高度同晶性。然而，各数据集完整度有限且可变（58.2%–68.4%），使基于单一数据集的结构精修无法收敛至稳定模型。研究人员的策略是，使用XSCALE基于共同反射强度相关系数（CCI）进行同晶性评估后再合并数据集。合并后数据集合共计9529个测量反射和3892个独立反射，在0.87 ?分辨率下总体完整度为90.9%，R_int = 0.2602，R_σ = 0.3002。合并数据集精修收敛至观测反射R1 = 0.192，所有反射R1 = 0.280，拟合优度为1.382。这些残差虽高于SCXRD的典型值，但与3DED精修中通常报道的数值一致（动力学散射效应未在运动学精修模型中明确建模）。精修后的键长、键角和整体分子几何均化学合理。

**（5）1a与SARS-CoV-2 3CL^pro的共价对接分析**

以AutoDockFR进行的共价对接将Cys145指定为共价反应位点。所得模型将肉桂酰胺迈克尔受体定位于Cys145附近，允许半胱氨酸硫醇盐对缺电子双键进行1,4-加成。Cys145 Sγ原子与迈克尔受体β-碳之间形成硫醚键，Sγ–Cβ距离为1.81 ?，Cα–Cβ–Sγ角为113°。1a延伸跨越底物结合裂隙，占据S1、S1′、S2和S4亚位点。结合模式通过多个非共价相互作用进一步稳定：与Glu166、Asn142、Cys145主链、Gln189和Ser144形成氢键接触，从而与氧阴离子环（oxyanion-loop）和S1口袋区域结合；还与S2亚位点的Met165、S4亚位点的Gln189和S1′亚位点附近的Leu27形成额外接触。1a的芳香片段与His41形成T型π堆积相互作用，因此催化二联体（catalytic dyad）的两个残基均在模型复合物中被结合：His41贡献芳香性识别，Cys145形成共价连接。

**五、总结与研究结论**

本研究利用3DED成功实现了对传统SCXRD不适用的辐照敏感纳米晶药物化合物的原子级结构测定。通过将低剂量cRED与数据集合并策略相结合，获得了高完整度数据集，尽管倒易空间覆盖存在固有限制，仍实现了亚埃级分辨率的可靠结构解析和精修。解析所得结构定义了一种SARS-CoV-2 3CL^pro肉桂酰胺共价抑制剂的固态构象，并确立了迈克尔受体的几何特征，证明3DED能够提供仅通过分子设计或生化试验难以获得的化学信息性结构细节。更广泛而言，该工作突显了3DED作为结构挑战性有机和药物体系的多功能晶体学工具的日益增长的潜力，并强调了其在基于结构的分子设计和发现中的价值。