高通量单管质谱多组学平台同步解析番茄果实发育中的代谢物、脂质、蛋白与天然肽动态变化

《Analytical Chemistry》：Single-Tube Mass Spectrometry-Based Workflow for Multi-Omics Profiling of Diverse Biomolecules

　　

基于质谱（mass spectrometry, MS）的组学技术进步使生物学过程的深入解析成为可能。然而，从同一生物样本中稳健检测多种生物分子类型仍具挑战。研究人员建立了一套多组学（multi-omics）平台，可从单管中同时高通量检测极性（polar）与半极性（semi-polar）代谢物、脂质、蛋白质和天然肽（native peptides）。作为该平台的概念验证，研究人员分析了番茄果实发育过程中显著且动态的分子变化，包括优化样本采集、标准化色谱系统的数据采集，以及开发整合多种组学技术的生物信息学流程。在多个组学层级中，研究人员检测到数千种生物分子，其丰度在果皮和果肉组织的果实发育过程中发生显著变化，并提供了可区分果实发育阶段的时间特征。其中包括大量天然内源肽（endogenous peptides）的系统表征，这些肽的组成和切割偏好呈现动态变化。最后，研究人员展示了利用机器学习（machine learning, ML）框架对这类高通量数据进行无监督整合。总体而言，该多组学平台能够对多样化生物组织和生物流体进行系统解析，并在多个研究领域具有广泛适用性。

研究背景：番茄果实成熟涉及初级代谢、次级代谢、脂质重塑和蛋白表达重编程。传统流程分开提取各分子类，存在样本处理差异和跨组学整合困难；现有单样本流程覆盖有限，内源天然肽也因丰度低、性质复杂而少被系统研究。研究人员开发单管质谱（MS）多组学（multi-omics）平台，同步检测极性（polar）、半极性（semi-polar）代谢物、脂质、蛋白和天然肽（native peptides），并以Micro-Tom番茄果皮和果肉八个发育期为概念验证，建立阶段时间特征并解析天然肽动态变化，为植物组织和生物流体研究提供可迁移方法。

关键技术与样本队列：研究人员采用改良双相提取（甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇/水）将同一约100 mg组织分为水相（极性、半极性代谢物和天然肽）、有机相（脂质和色素）与蛋白沉淀；分别经液相色谱-质谱（LC-MS）采集；用TraceFinder、LipidSearch、UNIFI、FragPipe和pmartR完成鉴定、归一化与差异分析，数据经log₂转换，并用MOFA+无监督整合；样本为Micro-Tom番茄果皮和果肉八发育期、重复不少于三。

结果：开发多组学平台：通过单管双相分配和不同LC-MS路径同步获得代谢物、脂质、蛋白和天然肽数据。实验设计与成熟阶段：八阶段和两类组织的重复设计使跨组学与跨组织比较可直接进行。全面检测：果肉和果皮分别鉴定35533和20902条天然肽，蛋白分别为6851和6910；果肉还检测319个极性代谢物、209个半极性代谢物、712个脂质和23个色素，显示平台分子覆盖广。差异分析揭示组学层级轨迹：主成分分析（PCA）中蛋白丰度沿PC₁成熟推进，天然肽在PC₁和PC₂分离更明显，可分辨中期阶段；代谢物和脂质也区分早期与晚期。差异分子谱：在假发现率（FDR）≤0.05下，相邻阶段比较显示MG vs IG和LOR vs EOR等转换变化比例高；果肉有5858个差异表达蛋白、32130条差异天然肽、286个极性代谢物、174个半极性代谢物和684个脂质；色素表现为叶绿素和脱镁叶绿素类下降，番茄红素上升，叶黄素类下降。果实肽组学特征：大量非酶解来源的天然肽呈阶段特异模式，并与蛋白或代谢物共变。天然肽长度与来源：肽长集中在10-12 aa，果肉中位13 aa、平均13.2 aa，果皮中位12 aa、平均14.2 aa；7533个潜在母蛋白中44%仅由单一肽段代表，少数母蛋白分别对应多达2232条和1863条肽，提示受控切割与部分蛋白广泛加工。切割位点偏好：果肉41331条肽的C末端氨基酸中A、E和G富集，I和L偏少；C、R、G和I在后期增加，P和D在早期更频繁，部分趋势显著（P_adj <0.05），提示蛋白水解景观随发育变化。ASR1与PME肽组学：脱落酸胁迫-成熟蛋白1（ASR1）和果胶甲酯酶（PME）的不同区域肽段在不同阶段呈现不同轨迹，不能简单加总为完整蛋白丰度；其模式与ASR1参与成熟、PME参与细胞壁修饰一致。多组学无偏整合：MOFA捕获多数组学60%-90%方差，极性代谢物和果肉脂质解释率低于20%；十个潜因子分别反映果皮与果肉早期/晚期差异、特异阶段和通路，其中因子2关联光合相关蛋白，因子3关联氧化脂质（oxylipin）、固醇（sterol）和类固醇（steroid）代谢，因子4关联氨基酸代谢；蛋白与脂质的同因子关联揭示了成对差异分析未显示的跨组学联系。

结论：该整合工作流在单一样本中同步获得五类分子信息，提供番茄果实发育的时间分辨资源，并支持跨层关联分析。天然肽分析显示高多样性和高时间分辨率，但样品制备中残余体外蛋白水解不能完全排除；检测肽段7-65 aa部分受数据库搜索和分配选择性限制，且并非所有内源肽均可被质谱检测。极性代谢物解析中心碳氮代谢，半极性代谢物和色素追踪类黄酮、类胡萝卜素及叶绿素降解物，脂质组学反映膜脂和存储脂重塑。PCA和重复样本聚簇表明方法可重复。平台具有模块化，可省略或保留特定组学，可能适用于其他植物组织、有限样本材料和不同生物流体。