《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：MPNN-Guided Redesign of PET Hydrolases with Enhanced Catalytic Activity below the PET Glass Transition Temperature
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以下是论文摘要部分的专业翻译，以研究人员代替"我们"，专业术语均以括号备注英文缩写并保留原文符号和上下角标：
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的酶促解聚为塑料循环利用提供了一条可持续的途径，但其工业可行性受到需要在温和、节能条件下具有活性的热稳定性酶的制约。尽
以下是论文摘要部分的专业翻译，以研究人员代替"我们"，专业术语均以括号备注英文缩写并保留原文符号和上下角标：
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的酶促解聚为塑料循环利用提供了一条可持续的途径，但其工业可行性受到需要在温和、节能条件下具有活性的热稳定性酶的制约。尽管聚酯水解酶Leipzig 7（PHL7，也称为PES-H1）在该聚合物玻璃化转变温度（约65 °C）附近能够快速降解无定形PET，但其较差的蛋白质表达水平、在60 °C以上失活以及低于60 °C时缓慢的解聚速率限制了其实际应用。在本研究中，研究人员采用ProteinMPNN和LigandMPNN，结合结构及进化信息，对PHL7的序列进行重新设计，以改善蛋白质表达、热稳定性和催化活性。研究人员从36个经实验测试的变体中鉴定出2个（D5、D11）在50 °C下表现出增强的PET解聚能力，其效率与PHL7在70 °C下相当，但产物谱发生偏移，偏好生成单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET）而非对苯二甲酸。分子动力学模拟揭示，这些重新设计的变体在活性位点区域表现出增强的柔性，为其低温催化提供了机制层面的理解。这些变体为实现经由MHET缩聚反应再合成原生PET提供了潜在途径，为高效循环经济提供了可行方案。
以下是关于论文主体内容的学术性解读文章：
**研究背景与科学问题**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是全球使用最广泛的塑料之一，2024年全球产量约2670万吨。大多数PET产品（如瓶子、食品包装）被归类为一次性塑料，导致其成为废弃量最大的聚合物之一，造成严重的环境污染。为解决这一问题，PET的酶促降解（即PET水解酶，PETases）被视为传统回收方法的重要补充方案，尤其适用于机械回收无法处理的塑料原料（如纺织品、纤维、层压包装材料和热成型PET）。PETase具有高特异性，可在温和水相条件下将PET解聚为高纯度对苯二甲酸（TPA）、乙二醇（EG）及中间产物单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET），这些产物可再聚合为原生品质的PET，实现闭环回收。然而，天然来源的PETase并未为工业回收过程优化，热稳定性、催化活性和低蛋白表达水平等问题成为其大规模应用的关键瓶颈。聚酯水解酶Leipzig 7（PHL7，又称PES-H1）是一种来源于Thermoanaerobacter sp.的宏基因组酶，熔解温度（Tm）为79 °C，能在70 °C左右于16小时内解聚无定形PET薄膜，展现出理想特征。但其应用受限于在大肠杆菌中重组表达时的低蛋白产量，以及其工作温度接近Tm所导致的快速活性丧失。此外，酶的理性设计本身极具挑战性，微小残基替换可能引起显著失稳和活性损失。为此，研究人员采用深度学习固定骨架序列设计工具ProteinMPNN和LigandMPNN，结合进化信息，对PHL7进行序列重新设计，旨在改善其蛋白表达、热稳定性和催化活性，推动其工业生物回收应用。
**研究内容与总体结论**
研究人员以TPA结合的PHL7晶体结构（PDB ID 8BRB）为输入骨架，将距离配体6 ?范围内的残基定义为活性位点残基并在重设计过程中固定。通过hhblits在Uniref30数据库中迭代搜索生成16个多序列比对（MSA），依据30%、50%、70%序列保守性阈值筛选需固定的进化保守残基。最终选出49组固定残基组合，分别使用ProteinMPNN和LigandMPNN各生成588条序列，共1176条。经ESMFold结构预测、pLDDT（结构置信度指标）和Cα均方根偏差（RMSD）过滤后，利用Levenshtein距离矩阵聚成36个代表性序列簇进行实验验证。实验结果表明，36个变体中31个成功表达纯化，多数变体产量高于PHL7（纯化PHL7平均产量5 mg/L培养物，设计变体平均产量275 mg/L培养物），其中D5和D11产量分别提高28倍和66倍。然而，所有27个可测变体的Tm均低于PHL7，平均降低16 °C。在60、70、80 °C活性筛选中，仅D5和D11在60 °C下表现出PET降解活性，且D5活性超过PHL7。在50 °C下，D5和D11对微米级PET（microPET）的24小时解聚效率与PHL7在70 °C下相当（D5达32.4%，D11达28.7%，PHL7在70 °C为43.8%），且产物谱偏向MHET而非TPA。分子动力学模拟揭示D5和D11活性位点区域（尤其负责PET结合的W-loop和含催化天冬氨酸的D-loop）柔性增加，解释了其低温催化机制。这些变体为通过MHET缩聚再合成原生PET提供了潜在途径，展示了工业生物回收的应用前景。
**关键技术与方法**
研究人员采用了以下核心技术方法：（1）**深度学习固定骨架序列设计**：使用ProteinMPNN和LigandMPNN两种逆折叠工具，结合结构信息与进化保守性信息进行序列重设计；（2）**计算结构预测与过滤**：运用ESMFold预测三维结构，以pLDDT和Cα-RMSD为指标筛选，并用Rosetta3 FastRelax进行能量最小化；（3）**高通量实验筛选体系**：在大肠杆菌中进行微规模（2 mL）和高通量纯化，结合圆二色光谱（CD）和差示扫描荧光法（DSF）评估结构折叠与热稳定性，通过240 nm吸光度和酚红pH指示剂双重读出进行PET降解活性筛选；（4）**多尺度酶动力学表征**：利用聚己内酯（PCL）纳米粒子浊度下降法和反Michaelis-Menten方程测定动力学参数，通过高效液相色谱（HPLC）定量PET降解产物；（5）**分子动力学（MD）模拟**：使用AMBER 2024软件包和ff19SB力场，在50、60、70 °C下对PHL7及变体进行3×200 ns独立轨迹模拟，分析Cα均方根波动（RMSF）以评估区域柔性变化；（6）**结构能量学分析**：利用Rosetta3/PyRosetta计算总能量和盐桥网络等物理化学参数，并使用Boltz-2进行蛋白质-配体共折叠结构预测。样本涉及消费后无定形PET薄膜和PET纳米颗粒（经动态光散射DLS表征粒径8422 nm，多分散指数0.200，zeta电位-34 mV）。
**研究结果**
**1. 序列重设计与高通量筛选**：通过固定活性位点和进化保守残基的策略，利用ProteinMPNN和LigandMPNN生成1176条序列，经严格计算过滤后聚类挑选36条代表序列。实验表达纯化结果显示大多数重设计变体蛋白产量较PHL7显著提高（最高超120倍），证实了深度学习设计工具在改善蛋白可表达性方面的有效性。但热稳定性分析显示所有变体Tm均低于PHL7，与预期相反。
**2. PET降解活性筛选与变体鉴定**：在60、70、80 °C下对31个成功表达的变体进行PET薄膜降解筛选，仅D5和D11两个变体在60 °C显示降解活性。D5在60 °C的产物积累量超过PHL7。两个变体在微规模和1 L大规模培养中均表现出显著提高的蛋白产量（D5为7倍，D11为13倍），确认了重组表达改善。
**3. PCL降解与活性-稳定性权衡**：以PCL纳米粒子为底物的降解实验显示，D5和D11的最佳活性温度约为50 °C，在65 °C活性大幅下降；PHL7在50-65 °C间活性下降较小。动力学参数显示PHL7在50 °C的催化速率常数（kτ = 81.24 × 10?3/min）远高于D5（14.94）和D11（5.16），吸附平衡常数也更高。但PHL7在24小时PET降解中总产量反而低于D5，提示PHL7在长时间反应中因失活导致总降解量下降，而D5以较慢速率维持更长时间活性。
**4. microPET降解与产物谱分析**：通过HPLC定量24小时降解产物，发现在50 °C下D5和D11的PET转化率分别为32.4%和28.7%，与PHL7在70 °C下的43.8%相当，较其自身在70 °C的转化率（5.7%和4.1%）提高6倍和7倍。关键发现是D5和D11在50 °C下产生的MHET多于TPA，而PHL7产生更多TPA，这种产物谱差异可能有利于更高效的PET再聚合路径。
**5. 动力学参数与温度依赖性**：采用反Michaelis-Menten方程测定的初始速率显示PHL7在饱和条件下转换率高于D5和D11，但无法捕捉长时间反应中的失活现象。D5和D11的invKM随温度升高而降低，与PHL7趋势相反，反映低温下底物亲和力优势。
**6. 结构分析与分子动力学模拟**：序列比对显示D5和D11分别含39和40个替换（共享20个），活性位点除D5的L93T和Q95L外高度保守。Rosetta3能量分析显示设计中多数替换能量更有利，但盐桥网络系统性减少与Tm降低一致。MD模拟揭示D5和D11在W-loop和D-loop区域柔性显著增加，D5的Q175E突变与该区域柔性增强相关，D11的柔性变化则源于远离活性位点的突变。
**讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，本研究表明深度学习引导的序列设计能有效产生蛋白表达量提高且在温和温度下具有高活性的PET降解酶。D5和D11在50 °C下与PHL7在70 °C相当的降解效率，以及MHET产物偏好，使其成为工业生物回收的有力候选者。研究存在两方面局限：未在工业常用宿主（如Bacillus spp.、Aspergillus spp.或Trichoderma spp.）中验证表达提升；未在模拟工业条件的小型生物反应器中测试效率。变体呈现活性-稳定性权衡：热稳定性降低换来构象柔性增加，从而实现低温高效催化，类似于中温PET水解酶的特征。MD模拟确定了柔性增加集中在PET结合和催化区域的结构基础。研究未能获得热稳定性提高的变体，可能归因于PHL7本身的高热稳定性限制了提升空间，以及仅测试了3%生成序列的预算限制。未来可借助HyperMPNN等新工具、MD模拟辅助序列筛选及更广泛的温度条件测试来优化设计策略。
结论部分核心内容翻译如下：总之，本研究证明深度学习引导的设计与活性筛选能有效产生从异源表达中获得更高蛋白滴度且在中等温度下具有高活性的PET降解酶，为计算通量超出实验能力时如何导航序列选择策略提供了实践指导。这些设计酶因在温和温度下的高效率而可能成为工业装置的强候选者，同时可减少蒸发损失。其在50 °C的高PET解聚效率使其与中温宿主全细胞生物催化等其他工艺更加兼容。这些结果表明，增强的低温活性可以以热稳定性为代价而出现，揭示了可设计的活性-稳定性平衡。所有这些使研究人员更接近不同类型生物回收系统的改进，这对于实现可扩展且经济可行的循环PET经济至关重要。
