《The Journal of Physical Chemistry Letters》：Activating Photoreaction of Indazole Metastable-State Photoacid through Two-Photon Excitation
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亚稳态光酸（mPAHs）的光反应及其功能性迄今几乎完全通过单光子激发进行研究。本文报道了一种高水溶性吲唑mPAH水溶液的双光子激发荧光（TPEF）光谱研究。研究发现，该可轻易观测的荧光发射不仅遵循预期的二次方强度依赖关系，而且具有约53 GM的显著双光子吸收截
亚稳态光酸（mPAHs）的光反应及其功能性迄今几乎完全通过单光子激发进行研究。本文报道了一种高水溶性吲唑mPAH水溶液的双光子激发荧光（TPEF）光谱研究。研究发现，该可轻易观测的荧光发射不仅遵循预期的二次方强度依赖关系，而且具有约53 GM的显著双光子吸收截面（two-photon absorption cross-section, σ）。在单光子和双光子激发下观测到的明显不同的时间分辨荧光衰减和发射光谱，为不同异构体及其各自光反应相关路径的激活提供了间接证据。研究结果为解锁这些mPAHs在单光子激发下无法实现的新功能和应用开辟了有前景的途径。
论文解读
一、研究背景与科学问题
亚稳态光酸（metastable-state photoacids, mPAHs）是一类能够在光反应过程中可逆地产生高质子浓度并维持长寿命酸性状态的光响应分子。这种独特的能力不仅激发了大量令人瞩目的应用研究，包括药物递送、离子通道激活、离子传感、耗散组装和合成转化等，也推动了利用多种光学光谱技术识别其潜在光诱导结构变化（photoinduced structural changes, PSCs）和竞争性电子激发态过程的基础研究。
然而，一个关键的科学局限在于：迄今为止，几乎所有关于mPAHs的研究都基于单光子激发下的稳态或时间分辨光谱测量，仅有两项例外研究涉及其他激发方式。单光子激发在激发波长选择、穿透深度和空间分辨率方面存在固有局限，无法触及某些特定的电子激发态，从而限制了mPAHs潜在功能的发掘。双光子激发（two-photon excitation）能够直接进入单光子激发通常无法到达的电子激发态，可能引发截然不同的光反应路径、PSCs和激发态弛豫过程，进而催生新的功能与应用。因此，探索mPAHs在双光子激发下的光反应行为具有重要的科学意义和应用价值。
二、研究内容与主要结论
针对上述问题，研究人员对一种高水溶性吲唑mPAH开展了系统的双光子激发荧光（two-photon excited fluorescence, TPEF）光谱研究。该分子在结构上与其他mPAHs存在差异：吲唑部分连接了SO??取代基，苯并噻唑侧增加了酯基。该吲唑mPAH的光反应机制在先前的研究中已有揭示：光照射在水溶液中生成醌型顺式（cis）异构体，其酸性高于反式（trans）异构体；去质子化的cis异构体是螺环（spiro）形成和逆向cis-to-trans反应的共同中间体。
研究人员利用中心波长为804 nm、脉宽约50 fs的飞秒脉冲激发1 mM水溶液，观测到肉眼可直接可见的荧光发射。通过改变激发功率并测量时间分辨荧光（time-resolved fluorescence, TRF）衰减，研究人员确认了荧光强度与激发功率之间的二次方依赖关系（log-log图斜率为2.13 ± 0.09），验证了双光子激发起源。利用罗丹明6G（R6G）作为标准物，通过比较法估算出该吲唑mPAH的双光子吸收截面约为53.5 GM，与R6G在可比光谱范围内的65 ± 9 GM接近，这解释了为何该分子尽管荧光量子产率比R6G低180多倍，仍能观测到显著的TPEF信号。
进一步的时间分辨和频率分辨荧光（time- and frequency-resolved fluorescence, TFRF）测量揭示了单光子和双光子激发之间的显著差异。在560 nm处，双光子激发的TRF衰减明显慢于单光子激发。定量拟合分析表明，单光子衰减需要双指数模型（寿命为25 ps和60 ps），而双光子衰减则需要三指数模型（寿命为23 ps、69 ps和409 ps），其中最慢分量的相对振幅虽小（1.2%），但其分数强度占比达9.2%，排除了杂质来源的可能性。此外，时间积分TPEF发射光谱相比单光子激发的稳态发射光谱出现明显的红移和长波侧特征峰。光谱解卷积分析显示，TPEF光谱需要两个高斯分量（峰值分别位于564.4 nm和637.1 nm）才能满意描述。这些差异为单光子和双光子激发涉及不同异构体及其相关光反应路径提供了间接证据。
在宏观验证方面，研究人员尝试用非聚焦光束（1/e2直径936 μm，平均功率220 mW）连续照射样品溶液，但pH计测量未检测到可可靠验证的pH变化，这与单光子激发下pH从6.55降至3.88的显著变化形成鲜明对比。连续照射7小时后，trans异构体在418 nm处的吸收仅下降约5%，且在黑暗中放置1小时未观察到吸收恢复，表明双光子激发引发的效应在系综水平上过小而难以通过常规光谱手段检测。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键实验技术：时间相关单光子计数（time-correlated single-photon counting, TCSPC）装置用于时间分辨荧光测量，配备超稳定Gemini干涉仪实现频率分辨检测能力，以及混合光电倍增管探测器组件（时间分辨率<50 ps）；飞秒再生放大器（RegA 9050, Coherent）产生804 nm、50 fs、6 μJ脉冲作为激发光源，通过BBO晶体倍频获得402 nm单光子激发脉冲；紫外-可见吸收光谱使用Shimadzu UV-1900i光谱仪；稳态荧光光谱使用Fluorolog-QM荧光光谱仪。双光子吸收截面通过以R6G甲醇溶液为标准的比较法确定。
四、讨论与结论
研究人员指出，双光子激发发生在聚焦激光束的有限体积内或非聚焦高强激光束的传播路径上，因此光反应和质子释放具有空间局限性，这使得pH和吸收光谱检测面临挑战。研究还提出，由于mPAHs的逆向反应速率（该分子半衰期约7.2分钟）远慢于常用脉冲激光系统的重复频率，单光子激发下反复照射同一或相似样品体积将不可避免地导致不同异构体的积累，使得识别各异构体相关的光谱和动力学特征极为困难。相比之下，双光子激发借助聚焦激光束可提供明确的激发体积，使每个连续激光脉冲都能接触到新鲜的样品体积，从而可能克服这一技术挑战。
研究结论指出，这是首次从mPAH水溶液中观测到TPEF发射。该荧光发射不仅遵循预期的二次方强度依赖关系，而且具有约53 GM的显著双光子吸收截面，仅比文献报道的份菁在氯仿中700 nm处的80 GM小约30%。双光子激发下观测到的TRF衰减和时间积分发射光谱与单光子激发结果存在明显差异，为不同异构体及其相关光反应路径的激活提供了间接证据。这些发现为解锁mPAHs在单光子激发下无法实现的新功能和应用开辟了有前景的途径，具体包括：促进具有大共轭和极化率的双光子吸收异构体的形成；利用双光子激发增强穿透深度和紧聚焦体积实现精准靶向药物递送和激活；为离子通道激活、离子传感、耗散组装和合成转化等mPAH介导过程提供更好的时空控制；以及利用双光子激发明确的激发体积来识别复杂光反应中涉及的不同异构体。
