阿拉伯胶与猴面包树益生元发酵产物通过基因组指导的碳水化合物活性酶（CAZyme）预测抑制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）毒力表型的机制研究

《Frontiers in Microbiology》：Genome-guided prebiotic fermentation generates anti-virulence metabolites against Pseudomonas aeruginosa

　　

摘要专业翻译 背景： 多重耐药铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的日益增多，使得基于微生物组的抗毒力策略备受关注，该类策略旨在降低病原菌致病性而不直接影响其存活。本研究探讨了益生菌发酵阿拉伯胶（Arabic gum）和猴面包树（baobab）所产生的代谢产物是否能够降低铜绿假单胞菌的毒力。 方法： 研究人员比较了长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和铜绿假单胞菌的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes）谱，以预测其利用植物聚糖的能力。在补充阿拉伯胶、猴面包树或葡萄糖后，测定了益生菌的生长、活菌数和酸化程度。评估了未处理、中和处理及pH匹配的无细胞上清液（cell-free supernatants, CFS）对铜绿假单胞菌生长、生物膜形成、黏附和蹭行运动（twitching motility）的影响。 结果： 植物乳植杆菌和长双歧杆菌分别含有54和53个糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs），而铜绿假单胞菌仅有29个，表明益生菌具有更优越的植物聚糖利用能力。2%阿拉伯胶显著提升了长双歧杆菌的活力约0.27 log10 CFU mL?1（P = 0.0058），并引起最大程度的pH降低；而葡萄糖使植物乳植杆菌生长增加约0.58 log10 CFU mL?1（P = 0.0019）。源自阿拉伯胶的上清液表现出最强活性，几乎完全抑制了生物膜形成，将黏附力降低约54%，并显著抑制蹭行运动。猴面包树表现出可测量但总体较弱的益生元和抗毒力效应。这些发现表明，生物学效应取决于发酵底物及由此产生的代谢产物谱。中和处理减弱了部分抑制效应，而pH匹配对照在很大程度上重现了相应CFS所观察到的生长抑制作用，表明发酵相关酸化是抗菌活性的主要决定因素。在某些中和处理的CFS制剂中观察到的残余活性提示，在特定条件下可能有其他非酸性因子参与。 结论： 基于基因组信息的聚糖利用预测鉴定出了能够产生益生菌代谢产物的底物，这些代谢产物可减弱铜绿假单胞菌的多种毒力表型。阿拉伯胶在基于微生物组控制多重耐药铜绿假单胞菌方面显示出特别的应用前景。

论文解读

一、研究背景与意义

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰阴性机会性病原菌，是医院获得性感染和社区获得性感染的重要病原体，尤其威胁免疫功能低下患者和患有基础疾病的人群。该菌常与呼吸道感染、慢性伤口感染、尿路感染、血流感染及医疗器械相关感染密切相关。由于该病原体具有卓越的适应能力和固有的多重耐药性，其感染治疗面临严峻挑战。除抗菌药物耐药性外，铜绿假单胞菌的临床重要性还源于其众多毒力因子，其中生物膜形成是关键致病特征，可促进细菌持续存在、逃避宿主免疫应答并增强对抗菌治疗的耐受性。因此，与生物膜形成相关的铜绿假单胞菌感染往往呈慢性、复发性且难以根除，显著导致治疗失败并加重医疗负担。鉴于其多重耐药性、适应性和生物膜形成能力，铜绿假单胞菌被列为高优先级耐药病原体，是全球重大公共卫生问题。

传统抗菌疗法旨在抑制细菌生长或直接杀灭细菌，然而耐药性的日益加剧促使研究策略转向抗毒力方向，即靶向致病行为而非细菌存活性。这类策略旨在破坏关键毒力因子，如黏附、生物膜形成、群体感应和宿主定植，从而在降低细菌致病性的同时施加较小的耐药选择压力。阿拉伯胶和猴面包树是富含多糖的植物源膳食纤维，作为天然益生元底物受到广泛关注。阿拉伯胶主要由高度分支的阿拉伯半乳聚糖多糖组成，而猴面包树果肉富含果胶多糖。植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）被选为有益菌群模型。尽管阿拉伯胶和猴面包树已被探索作为益生元底物，益生菌代谢产物也显示出抗病原特性，但将基因组指导的聚糖利用预测与微生物组介导的抗铜绿假单胞菌毒力活性的实验验证相结合的研究仍然匮乏。此外，阿拉伯胶和猴面包树条件化无细胞上清液对黏附相关表型（如生物膜形成和蹭行运动）的影响尚未得到充分表征。因此，本研究旨在建立连接CAZyme底物预测、益生菌发酵和微生物组来源的铜绿假单胞菌毒力抑制的综合框架。

二、主要关键技术方法

本研究采用基因组指导与实验验证相结合的方法。首先，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库获取三种细菌的基因组装配或预测蛋白序列，利用dbCAN网络服务器进行CAZyme注释，通过HMMER、DIAMOND和dbCAN-sub等工具自动注释糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶和碳水化合物结合模块，据此预测各菌株对阿拉伯胶和猴面包树主要聚糖组分的利用潜力。其次，以1%和2%（w/v）浓度的阿拉伯胶和猴面包树果肉粉末为发酵底物，1%葡萄糖为阳性对照，无底物培养基为阴性对照，对长双歧杆菌（LMG 11047）和植物乳植杆菌（ATCC 8014）进行发酵培养，通过OD₆₀₀测定、活菌平板计数和pH测定评估益生菌生长和发酵活性。随后制备三种无细胞上清液制剂：未处理CFS、NaOH中和至pH 7.0的CFS-N以及新鲜无菌培养基调整至对应CFS相同pH的CFS-pH对照，以区分酸介导效应与非酸性代谢产物效应。最后，通过96孔微量板法评估各制剂对铜绿假单胞菌（ATCC 27853）生长、早期黏附（45分钟结晶紫染色法）、生物膜形成（24小时结晶紫微量板法）和蹭行运动（琼脂穿刺法）的影响，以头孢洛扎/他唑巴坦作为阳性抗生素对照。所有实验均设3次独立生物学重复，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较检验进行统计分析。

三、研究结果

3.1 基因组指导的有益菌和铜绿假单胞菌植物聚糖利用预测

通过基于基因组注释的CAZyme比较分析发现，植物乳植杆菌和长双歧杆菌分别编码54和53个糖苷水解酶，而铜绿假单胞菌仅编码29个。糖基转移酶方面，植物乳植杆菌含量最高，其次为铜绿假单胞菌，长双歧杆菌编码22个。铜绿假单胞菌含有最多碳水化合物酯酶（n = 8），且是唯一预测编码多糖裂解酶（n = 3）的菌株，而两种益生菌均未检出多糖裂解酶。碳水化合物结合模块在三种菌中均存在。总体而言，有益菌拥有更广泛的聚糖降解酶谱，支持阿拉伯胶和猴面包树聚糖可能被有益菌群优先利用的假说。

3.2 植物聚糖利用的基因组指导预测

基于CAZyme谱的比较分析显示，长双歧杆菌对阿拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖和含葡萄糖醛酸聚糖具有高预测利用潜力；植物乳植杆菌对半乳糖、半乳糖醛酸和果胶来源聚糖具有高利用潜力；而铜绿假单胞菌对阿拉伯糖和阿拉伯半乳聚糖利用有限，对半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸聚糖为中等利用，对果胶来源聚糖为高利用。

3.3 有益菌的底物利用

底物补充显著影响两种益生菌的生长。对长双歧杆菌而言，1%葡萄糖引起最大浊度增加（平均ΔOD₆₀₀ = 0.239），2%阿拉伯胶次之（平均ΔOD₆₀₀ = 0.148），而1%阿拉伯胶和两种浓度猴面包树仅引起微弱或无增加。活菌计数方面，2%阿拉伯胶使长双歧杆菌活菌数较对照显著增加约0.27 log₁₀ CFU mL^?1（P = 0.0058），而葡萄糖和猴面包树未引起显著变化。对植物乳植杆菌而言，1%葡萄糖使活菌数增加约0.58 log₁₀ CFU mL^?1（P = 0.0019），阿拉伯胶和猴面包树未显著影响活菌数。pH测定显示，阿拉伯胶使长双歧杆菌培养pH降低约1.5个单位，猴面包树降低约0.5个单位，而葡萄糖仅引起轻微降低；对植物乳植杆菌，葡萄糖引起最显著酸化（降低约0.8个单位），阿拉伯胶和猴面包树仅引起有限酸化。

3.4 长双歧杆菌来源无细胞上清液对铜绿假单胞菌的底物依赖性抗菌活性

长双歧杆菌来源CFS对铜绿假单胞菌净生长有显著影响。阿拉伯胶来源的pH匹配对照（AG 1% CFS-pH和AG 2% CFS-pH）表现出最强抑制活性，几乎完全抑制细菌生长。猴面包树来源的中和CFS（BB 1% CFS-N和BB 2% CFS-N）及其pH匹配对照显著抑制生长约65–95%。未处理CFS中仅AG 2% CFS显著抑制铜绿假单胞菌。中和处理几乎完全消除阿拉伯胶来源CFS的抑制活性，而相应pH匹配对照保持强抑制，表明酸性环境是生长抑制的主要因素。相反，中和的猴面包树来源CFS保留了显著抑制活性，提示可能存在额外非酸性成分的贡献。

3.5 植物乳植杆菌来源无细胞上清液对铜绿假单胞菌净生长的影响

植物乳植杆菌来源CFS显著影响铜绿假单胞菌净生长。无底物CFS、BB 1% CFS和BB 2% CFS实现约100%的近乎完全抑制；阿拉伯胶来源CFS（AG 1%和AG 2%）、阿拉伯胶和猴面包树的pH匹配制剂以及GLU 1% CFS-pH显著抑制生长约52–94%。中和CFS普遍表现出极低或无抑制活性，部分甚至趋向促进细菌生长。pH匹配对照通常保持与相应原始CFS相当或更强的抑制活性。这些结果表明，发酵相关酸化是植物乳植杆菌来源制剂生长抑制活性的主要因素。

3.6 阿拉伯胶对铜绿假单胞菌生物膜形成的优越抑制作用

1%和2%阿拉伯胶几乎完全抑制生物膜形成，OD₆₀₀较未处理对照降低约0.49个单位（P < 0.0001），两种浓度间无显著差异。猴面包树（1%和2%）使生物膜生物量分别降低约0.16和0.10个单位，葡萄糖产生类似程度的降低。以百分比表示时，阿拉伯胶1%和2%达到近100%的生物膜抑制，而猴面包树、葡萄糖和抗生素仅表现出约20–33%的中等抑制。阿拉伯胶的抗菌膜效果显著优于猴面包树、葡萄糖和抗生素对照。

3.7 益生元补充对铜绿假单胞菌黏附的底物依赖性调节

1%和2%阿拉伯胶分别显著降低铜绿假单胞菌黏附约54%和51%（P < 0.05），与抗生素对照组效果相当。猴面包树虽使黏附降低约29%和21%，但未达统计学显著。葡萄糖反而增加细菌黏附，显著高于阿拉伯胶和猴面包树处理组及抗生素对照，表明葡萄糖有利于表面定植而非阻止细菌附着。

3.8 长双歧杆菌和植物乳植杆菌来源无细胞上清液对铜绿假单胞菌蹭行运动的影响

所有长双歧杆菌来源制剂均显著抑制蹭行运动，抑制值通常为60–85%。阿拉伯胶来源CFS持续表现出高抗运动活性，中和和pH匹配处理基本保持该活性。植物乳植杆菌来源制剂也显著抑制蹭行运动，但抑制程度受底物浓度和pH修饰的显著影响。1%阿拉伯胶、1%猴面包树和葡萄糖来源制剂表现出约70–90%的高抑制水平；而2%阿拉伯胶，尤其是中和或pH匹配处理后，抗运动活性逐渐减弱，其中AG 2% CFS-pH表现出最弱抑制。猴面包树和葡萄糖来源CFS无论中和或pH匹配均保持相对一致的抑制活性。

四、讨论与结论

本研究的CAZyme分析结果与此前比较基因组学研究一致，双歧杆菌属物种在人肠道菌群中具有最高的碳水化合物活性酶密度之一，植物乳植杆菌也以显著的碳水化合物代谢多功能性著称，而铜绿假单胞菌相对有限的CAZyme谱与其作为环境机会性病原体而非专职多糖发酵菌的角色相符。CAZyme分析准确预测了实验发酵结果，为选择性发酵实验提供了机制支持。发酵实验表明，底物组成显著影响益生菌的生长和代谢活性，阿拉伯胶尤其是2%浓度对长双歧杆菌产生最具生物学意义的响应，表现为活菌数增加和培养pH最大程度降低。OD₆₀₀与活菌数之间的差异具有生物学合理性，因为浊度测量的是总悬浮生物量，而菌落形成单位仅量化可复制的活菌。阿拉伯胶发酵后培养pH的显著降低支持长双歧杆菌通过果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶途径（双歧分流）主动发酵阿拉伯胶，产生乙酸和乳酸等主要发酵终产物。相比之下，葡萄糖虽促进植物乳植杆菌更多生长，但未持续产生最强的抗铜绿假单胞菌活性，表明益生菌发酵产物的生物活性更多取决于代谢产物组成而非细菌生物量本身。

通过未处理CFS、中和CFS和pH匹配对照的联合分析，研究人员揭示了发酵相关酸化在抑制铜绿假单胞菌生长中的重要作用。在多种条件下，调整至与相应CFS相同酸性pH的新鲜培养基复制或超过了CFS的抑制效果，而中和处理显著削弱抗菌活性。然而，某些中和制剂（特别是长双歧杆菌来源的猴面包树CFS）保留了残余抑制活性，提示非酸性发酵产物在特定条件下也可能发挥作用。阿拉伯胶与猴面包树之间的响应差异可能反映了所选益生菌纯培养体系中底物可及性的差异，而非猴面包树固有益生元价值较低。阿拉伯胶富含分支阿拉伯半乳聚糖结构，可能易于被长双歧杆菌和植物乳植杆菌编码的碳水化合物活性酶利用；而猴面包树含有低甲氧基化果胶多糖，其有效解聚可能需要专门的果胶降解微生物和群落交叉喂养。总体而言，本研究证实了阿拉伯胶作为选择性益生元底物，通过支持有益菌群活性并增强发酵产酸，产生能够减弱铜绿假单胞菌多种毒力表型的代谢产物，为基于微生物组控制多重耐药铜绿假单胞菌提供了有前景的策略。