端粒到端粒（T2T）基因组时代下非B型DNA结构的解析

《Annual Review of Genomics and Human Genetics》：Unraveling Non-B DNA Structures in the Era of Telomere-to-Telomere Genomes

　　

摘要专业翻译 端粒到端粒（T2T）基因组组装如今提供了基因组序列的完整表征，使得对非B型DNA结构——区别于经典B型DNA的二级构象——的探索成为可能。这些完全解析的基因组揭示了能够形成G-四链体（G-quadruplexes）、Z-DNA、三链体（triplexes）及其他非经典结构的基序的真实丰度与染色体分布，包括在以往无法触及的卫星DNA和重复序列区域中的分布。T2T组装还阐明了非B型DNA如何影响复制、重组、染色质组织和转录等关键生物学过程。此外，新出现的证据将非B型DNA结构与基因组不稳定性、突变热点和疾病病因学联系起来。跨物种的T2T比较分析正开始揭示作用于这些基序的进化模式和选择压力。整合先进的预测工具、基于人工智能的分析和实验验证，有望阐明非B型DNA在基因组功能、调控和进化中的多重作用。

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一、研究背景与科学问题

DNA双螺旋结构自1953年被发现以来，一直被视为遗传信息存储与传递的经典范式。然而，基因组中大量序列能够在特定条件下折叠成与经典B型DNA截然不同的非经典构象，这类结构统称为非B型DNA。它们包括三链DNA、G-四链体（G4s）、i-motifs、R-loops、十字形结构（cruciforms）、滑链结构和Z-DNA等。这些结构通常在特定序列基序处折叠，例如G4s形成于富含鸟嘌呤的基序G≥3N1–12G≥3N1–12G≥3N1–12G≥3，而十字形结构形成于反向重复序列，三链DNA形成于镜像重复序列。

长期以来，非B型DNA的研究受限于基因组组装的不完整性。基于短读长测序技术（如Illumina平台）生成的参考基因组存在大量缺口，尤其在重复序列丰富的区域，而这些区域恰恰是非B型DNA基序富集之处。更关键的是，短读长测序在非B型DNA基序处特别容易产生测序错误，导致对这类基序的数量估计和分布认知存在系统性偏差。这种局限性严重阻碍了研究人员对非B型DNA功能与进化的全面理解。

端粒到端粒（T2T）基因组的问世从根本上改变了这一局面。T2T基因组实现了每条染色体从端粒到端粒的无缺口组装，并通常能解析亲本单倍型，为研究个体提供了非B型DNA分布的完整图景。这类基因组由PacBio和Oxford Nanopore等多种长读长测序技术联合生成，对非B型DNA基序处的测序错误远低于短读长技术。人类X染色体是首个完成T2T组装的染色体，随后人类全基因组、Y染色体以及黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、婆罗洲猩猩、苏门答腊猩猩和合趾猿等猿类基因组的T2T组装相继完成，为系统研究非B型DNA提供了前所未有的数据基础。

二、研究内容概述

该综述系统梳理了T2T基因组时代非B型DNA研究的最新进展，涵盖非B型DNA基序在T2T基因组中的分布特征、生物学功能、与基因组不稳定性的关联以及进化意义。研究内容主要围绕以下几个方面展开：非B型DNA基序在T2T组装新增序列中的富集现象、不同染色体类型间的分布差异、卫星DNA和转座子元件中的非B型DNA特征、非B型DNA在复制、重组、染色质组织和转录中的功能角色，以及非B型DNA与遗传和基因组不稳定性的关系。

三、主要关键技术方法

研究人员综合运用了多种计算预测工具和实验检测技术。计算预测方面，采用了G4Hunter、pqsfinder、Quadron、PENGUINN、DeepG4、G4detector等基于分析算法、机器学习或深度学习的G4预测工具，以及Triplex、iM-seeker、DeepER、DeepZ、Z-DNABERT、ZSeeker等针对三链DNA、i-motifs、R-loops和Z-DNA的预测工具。实验检测方面，使用了基于化学反应性或核酸酶可及性的全基因组足迹法（如ssDNA-seq、KAS-seq、S1-seq、PDAL-seq）、基于抗体结合的CUT&Tag和ChIP-seq技术（如BG4 CUT&Tag、iMab CUT&Tag、R-loop CUT&Tag、G4 ChIP-seq、Z-DNA ChIP-seq）、Chem-map和CUT&Run等技术。样本来源包括人类HG002淋巴母细胞系、人类胚胎干细胞以及多种猿类的T2T基因组数据。

四、研究结果

2.1 非B型DNA基序在T2T组装新增序列中的过度代表性

与hg38参考基因组相比，T2T X染色体组装新增了近500个预测G4s，尤其以预测稳定性极高的G4s增益最为显著。T2T 8号染色体同样含有更多特别是稳定的G4s以及能形成十字形结构的反向重复序列，其中长反向重复序列的增加尤为突出。Y染色体T2T组装注释的非B型DNA序列基序数量是hg38版本的六倍，在着丝粒和Yq异染色质区域呈现特异性积累。跨物种分析显示，非B型DNA基序在T2T组装新增序列中普遍富集，人类X染色体的富集倍数最高（5.8倍），常染色体次之（4.9倍），Y染色体最低（2.8倍）。

2.2 T2T基因组中非B型DNA基序的总体含量与分布

不同猿类物种中，9.2%–15.1%的T2T基因组序列被注释为非B型DNA基序。其中反向重复、镜像重复、直接重复和短串联重复的丰度最高，每个基因组中检测到数百万个基序。不同非B型DNA类型之间存在大量注释重叠，提示同一DNA序列可能根据稳定性和细胞条件形成多种非B型结构。染色体分布方面，Y染色体的非B型DNA基序比例最高（12.2%–37.9%），X染色体最低（8.8%–11.4%），常染色体居中（9.2%–14.9%）。染色体内分布上，G4s在亚端粒区域富集，非B型DNA基序在近端着丝粒染色体的短臂和大多数染色体的着丝粒区域过度代表性。

2.3 卫星DNA中的非B型DNA

大多数着丝粒及其侧翼区域至少富集一种非B型DNA基序类型。60%的实验定义活性着丝粒显著富集至少一种非B型DNA基序，28%表现出至少两倍富集。反向重复序列在半数着丝粒中富集，而其他基序类型呈现物种和染色体特异性模式。α卫星的超染色体家族（SF01、SF1、SF4）分别富集不同类型的非B型DNA基序。rDNA阵列是所有非B型DNA类型（A相重复和反向重复除外）的富集位点，其中三链体基序的富集倍数高达基因组平均值的41倍，是人体基因组中三链体基序最丰富的元件。SST1卫星的重复单位间间隔区富含多种非B型DNA类型，包括G4s和Z-DNA（富集倍数达97倍）。HSat2和HSat3卫星序列因高串联重复含量常被预测形成滑链结构，其GAATG重复衍生物可形成鸟嘌呤拉链基序的稳定二级结构。

2.4 转座元件中的非B型DNA

T2T基因组揭示了猿类常染色体（41%–46%）、X染色体（51%–58%）和Y染色体（20%–41%）的转座元件（TE）含量差异。猩猩拥有最多具有完整开放阅读框的LINE-1（L1）元件（常染色体中502–554个），而非洲猿类（大猩猩、黑猩猩、倭黑猩猩和人类）有丰富的Alu插入。非B型DNA可能影响TE整合，G4基序和镜像重复在L1整合位点富集。SVA元件富集G4s、直接重复和镜像重复，但这些G4s在人类细胞中被甲基化，可能不以DNA结构形式形成。TE中的非B型DNA基序与人类疾病相关，如L1元件中的G4s在阿尔茨海默病神经元中积累，哺乳动物SINEs双链RNA衍生的Z-RNA通过使ADAR1脱氨酶遮蔽这些分子免于被MDA5识别而防止自身炎症。

2.5 基因中的非B型DNA

蛋白编码外显子中几乎所有非B型DNA类型的覆盖率均低于基因组平均值。G4s在编码链（非转录链）上尤其缺乏代表性，且在GC含量校正后，所有类型的编码区G4s均低于基因组平均值。利用长读长测序提供的5-甲基胞嘧啶甲基化信息，研究人员发现蛋白编码外显子中的G4s呈现甲基化水平的双峰分布，提示部分G4s仍可能形成。非蛋白编码基因中，RNA G4s（rG4s）是lncRNAs和其他非编码RNA中的关键功能元件，例如lncRNA GSEC形成的rG4结合并抑制解旋酶DHX36从而促进结肠癌细胞迁移，三链体结构有助于将lncRNAs锚定到染色质上。

五、讨论与结论

在复制方面，G4基序在核心复制起点和随机复制起点富集，早期复制区域与晚期复制区域的G4s存在差异甲基化。猿类T2T基因组分析揭示了20种不同的复制时序进化状态，支持非B型DNA通过诱导双链断裂导致节段性重复进而影响复制时序的假说。非B型DNA结构可阻碍复制性聚合酶ε和δ的进程，细胞通过解旋酶解绕、非复制性聚合酶（η和κ）复制以及修复通路校正等机制缓解这些冲突，但难以复制序列（DiToRS）区域仍是非B型DNA导致基因组不稳定性的主要位点。

在重组方面，人类T2T组装鉴定出近端着丝粒染色体间的伪同源区域，这些区域含有rDNA，促进染色体内重组事件并与升高的双链断裂率相关。约50%的PRDM9结合位点与至少一个潜在G4基序重叠，提示非B型DNA结构与减数分裂重组调控之间存在直接功能联系。G4s可能通过促进染色质可及性协助PRDM9结合，在缺乏经典Myers基序时，PRDM9可能仍能识别并结合G4结构。

在染色质组织方面，非B型DNA结构的形成主要发生在无核小体区域，其稳定通常需要负超螺旋。约99%的人类胚胎干细胞中检测到的G4s位于可及染色质区域。G4s在TAD边界强烈富集，可能通过远程G4s形成的分子间结构增强DNA环化。G4s还富集于兼性异染色质标记的双价启动子，并招募PRC2、RING1B、连接组蛋白H1和HP1α等异染色质因子，参与液-液相分离过程。人类胚胎干细胞分化诱导异染色质形成，伴随G4丰度降低2–4倍，而用PhenDC3稳定G4s可维持细胞多能性状态。

在转录方面，T2T基因组研究确认了G4基序在启动子、5′和3′非翻译区（UTRs）和增强子中的富集，且G4基序处的CpG位点呈低甲基化状态，提示这些结构可在这些区域形成。G4s本身被认为是核心启动子元件，突变G4序列会显著降低转录活性。G4s还常出现在剪接位点附近，与剪接和rG4s的稳定性及保守性相关。非G4结构方面，T2T Y染色体中基因内反向重复序列数量是旧参考基因组的六倍，Z-DNA基序与基因表达呈正相关。

在基因组不稳定性方面，非B型DNA结构通过干扰复制和转录促进突变发生，不同非B型DNA结构通过不同的修复加工机制刺激诱变。多个研究证实非B型DNA基序处单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（indels）的频率升高，且非B型DNA基序类型影响其侧翼区域的核苷酸替换频率。在染色体水平，Z-DNA、十字形DNA、G4s、R-loops和三链体与易位相关，反向重复形成的十字形结构是人类细胞（包括精子）中染色体易位的热点。

综上所述，T2T基因组为非B型DNA研究提供了完整而精确的序列基础，揭示了这类结构在基因组中的真实丰度、分布规律和功能角色。非B型DNA不仅是基因组调控的重要参与者，也是基因组不稳定性和疾病发生的重要因素。未来整合先进预测工具、基于人工智能的分析和实验验证，将有望阐明非B型DNA在基因组功能、调控和进化中的多重作用，并为理解人类疾病机制和物种进化提供新的视角。