《Annual Review of Genomics and Human Genetics》：Cryptic Splicing in ALS: From Driving Disease Progression to Unlocking Novel Therapeutics
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TDP-43是一种RNA结合蛋白（RNA-binding protein），调控RNA加工的多个层面，其从细胞核向细胞质的错误定位是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的一个标志性特征。虽然功能丧失和功能获得机制均参与疾病发生，但隐秘剪接（cryptic splici
TDP-43是一种RNA结合蛋白（RNA-binding protein），调控RNA加工的多个层面，其从细胞核向细胞质的错误定位是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的一个标志性特征。虽然功能丧失和功能获得机制均参与疾病发生，但隐秘剪接（cryptic splicing）的发现阐明了TDP-43核清除对神经元健康的下游影响。本文中，研究人员重点阐述核TDP-43的丧失如何驱动级联事件，导致细胞蛋白质稳态（proteostasis）受损，并形成正反馈循环（positive feedback loop），使神经元功能障碍持续恶化。这一过程维持了涉及轴突稳态（axonal homeostasis）和突触传递（synaptic transmission）维持的关键通路基因中隐秘剪接事件的出现。与对神经元健康的有害效应相反，隐秘剪接机制可被利用来开发新型治疗策略，前所未有地拓展了针对TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathies）的治疗途径。
**论文解读**
**一、研究背景与问题**
TDP-43由位于人类1号染色体的TARDBP基因编码，属于异质性核糖核蛋白（hnRNP）家族，是一种广泛表达且高度保守的RNA/DNA结合蛋白。全长TDP-43含414个氨基酸，其N端结构域介导同源二聚化以增强RNA加工活性，并包含两个RNA识别结构域、核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）；C端结构域又称低复杂度结构域（LCD），富含谷氨酰胺/天冬酰胺和甘氨酸区域，具有类朊病毒和易聚集特性。在生理条件下，TDP-43主要定位于细胞核，调控转录、染色质重塑、DNA双链断裂修复以及RNA加工和剪接等多个过程；在细胞质中，TDP-43参与转录本稳定性与翻译调控、mRNA运输及应激颗粒（stress granules，SGs）动力学调节。
2006年，TDP-43被鉴定为ALS和额颞叶痴呆（FTD）患者死后样本中泛素化胞质包涵体的主要蛋白。TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathies）指以TDP-43核耗竭和胞质聚集为病理特征的一系列进行性神经退行性疾病，约97%的ALS病例（除由SOD1和FUS突变引起的约3%外）和约45%的FTD病例（FTD-TDP）主要由TDP-43病理驱动。ALS导致上下运动神经元选择性死亡，引发进行性肌无力，患者通常于症状出现后2至5年内因呼吸衰竭死亡；FTD则主要影响皮质神经元，导致认知缺陷和行为改变。目前，除利鲁唑（riluzole）对生存期有轻微延长作用以及仅适用于SOD1 ALS患者的tofersen外，尚无获批的疾病修饰疗法。因此，明确触发神经元功能障碍的早期变化对于识别潜在治疗靶点至关重要。
在TDP-43蛋白病中，TDP-43从核内向胞质错误定位并聚集，功能丧失（LOF）和毒性功能获得（GOF）机制均被认为驱动神经退行性变。研究人员在本综述中重点讨论了将TDP-43 LOF定位为ALS和FTD中神经退行性变起始性和自传播性驱动因素的分子机制，尤其关注RNA加工缺陷及其对细胞蛋白质稳态、轴突稳态和突触传递的下游影响。
**二、关键技术方法概述**
本综述整合了多项研究的技术方法：利用交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）全面鉴定TDP-43结合的转录本靶标；通过RNA测序分析TDP-43耗竭神经元的转录组变化；采用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元作为体外模型；利用ALS、FTD、AD及包涵体肌炎（IBM）患者的死后组织样本进行验证；使用条件性TDP-43敲除小鼠模型和Tardbp突变小鼠模型研究体内表型；通过反义寡核苷酸（ASO）和CRISPR-Cas9技术进行剪接校正的功能验证；并采用U7小核糖核蛋白（U7 snRNP）系统和TDP-REG剪接门控系统进行治疗策略开发。
**三、研究结果**
*3.1 TDP-43核功能丧失：隐秘剪接与其他转录后事件*
TDP-43耗竭神经元的RNA测序数据显示广泛的转录组改变。Wong等研究组描述了成熟转录本中通常被抑制的内含子区域（称为隐秘外显子，cryptic exons，CEs）的异常包含，这些事件在ALS和FTD患者死后组织中特异性检出。隐秘RNA加工可表现为多种形式：内含子中的盒式外显子、仅5′或3′剪接位点为隐秘型导致现有外显子改变、新型外显子跳跃事件（skiptic exon）产生较短转录本，以及新型多聚腺苷酸化事件——包括诱导提前多聚腺苷酸化导致截短转录本（如STMN2）、内含子内多聚腺苷酸化（intronic polyadenylation）、或3′非翻译区（3′ UTR）内新型多聚腺苷酸化位点的使用导致3′ UTR延长或缩短。
CEs对编码蛋白的影响多样：(a) 隐秘和跳跃事件通过引入提前终止密码子（PTC）经无义介导的衰变（NMD）途径导致转录本降解和蛋白减少，如UNC13A和ATG4B；(b) 提前多聚腺苷酸化也可导致蛋白减少，如STMN2；(c) 框内事件导致新型蛋白生成，包含隐秘肽（cryptic peptides），如HDGFL2中的隐秘肽已在ALS患者脑脊液中检出，且可改变蛋白结合伴侣并触发T细胞免疫反应；KCNQ2中跳跃外显子导致显性负效应；(d) 隐秘3′ UTR事件可影响RNA稳定性，导致蛋白水平增加（如ELK1和MARK3）或减少（如NEFL）。
*3.2 正反馈循环：RNA与蛋白质调控紊乱的交汇*
*3.2.1 TDP-43自身调控*：TDP-43通过结合自身3′ UTR影响剪接、PolyA位点选择和核滞留来精确调控其蛋白水平。TDP-43促进内含子7剪接导致PolyA1丢失并生成不稳定转录本；也可促进内含子6和7剪接产生缺乏内在无序区的ΔIDR-TARDBP变体，经NMD降解或逃逸后生成截短蛋白，后者与胞质TDP-43异源二聚化并招募HSPA8经分子伴侣介导的自噬降解。在TDP-43蛋白病病例的额叶皮层中，TARDBP剪接受损与STMN2表达呈相关性。阻断hnRNPA1和hnRNPC结合位点的ASO可在体外和体内模型中恢复TARDBP剪接并减缓疾病进展，而过表达ΔIDR-TDP-43则通过过度隔离功能性TDP-43诱导细胞毒性。
*3.2.2 TDP-43与蛋白清除通路*：TDP-43作为自噬底物通过多种RNA加工事件调控自噬不同阶段。TDP-43与ATG7结合对其稳定化是必需的，ATG7在ALS-FTD死后样本中显著减少。ATG4B的CE包含引入PTC导致经NMD降解，逃逸的转录本产生缺乏磷酸化结构域的截短蛋白，损害其水解酶活性；在SOD1
G93A突变小鼠中，Atg4b耗竭显著缩短寿命，且ATG4B CE包含与ALS病程负相关。TDP-43 LOF还导致mTORC1正调控因子Raptor降解，增加TFEB核转位和自噬-溶酶体生物合成基因上调，但同时因DCTN1失稳损害自噬体-溶酶体融合，导致未成熟自噬囊泡积累引发神经毒性。TMEM106B的3′ UTR延长使其二聚体水平降低，而TMEM106B缺失导致轴突起始段增大内吞溶酶体积累。
*3.2.3 TDP-43功能丧失与应激颗粒动力学*：TDP-43通过调控G3BP1和TIA1支持SG组装。TDP-43耗竭使G3BP1转录本失稳并引入神经元特异性框内CE产生显性负效异构体，阻碍SG成核。TDP-43丧失也延迟TIA1阳性颗粒组装。在氧化应激条件下，SG通过作为SUMO2/3化的优先位点调控胞质无RNA结合TDP-43的溶解性和迁移性。当TDP-43浓度超过阈值且伴随氧化应激时，SG内TDP-43发生凝聚物内分相，液-固相转变导致病理性聚集体的形成，这些持久聚集体表现出泛素化和磷酸化特征，通过隔离游离TDP-43进一步加剧LOF。
*3.2.4 对其他RNA结合蛋白的影响*：TDP-43丧失导致ELAVL3 mRNA中CE包含，使其水平下降，ELAVL3异常的脊髓神经元出现线粒体运输改变和充满轴突货物的轴突肿胀。CELF5转录本也因CE包含而对NMD敏感，在TDP-43耗竭iPSC来源神经元中成为第三大下调蛋白，且CELF5在区分脆弱与抵抗性运动神经元的差异表达转录本中脱颖而出。
*3.3 TDP-43核功能丧失对轴突功能的影响*
*3.3.1 轴突细胞骨架动力学的破坏*
*STMN2*：TDP-43功能丧失导致STMN2转录本中包含含早期PolyA位点的CE，全长STMN2水平显著降低。STMN2在神经突起生长中起关键作用，其丧失导致轴突收缩、神经肌肉接头（NMJ）去神经支配和轴突运输改变，在小鼠中足以引起运动和感觉表型，并损害轴突切断后轴突再生。恢复STMN2水平可至少部分挽救TDP-43耗竭神经元的轴突再生缺陷。
*NEFL*：TDP-43丧失导致NEFL转录本发生替代PolyA事件，3′ UTR延长降低NEFL蛋白水平。NEFL是轴突细胞骨架中神经丝的关键组分，Nefl敲除小鼠表现出轴突口径减小和微小兴奋性突触后电流幅度降低。
*3.3.2 轴突稳态的多层面破坏*
*AARS1*：编码氨酰tRNA合成酶家族成员，催化丙氨酸与其同源tRNA的连接。TDP-43耗竭神经元和FTD-TDP/ALS-TDP死后组织中检出AARS1转录本中的框内CE，预测产生含隐秘肽的新型蛋白，该隐秘肽可触发免疫应答和T细胞克隆扩增。显性AARS1突变引起Charcot-Marie-Tooth 2N型周围神经病变，提示含隐秘肽的AARS1可能通过毒性GOF或显性负效机制参与ALS发病。
*ELK1*：TDP-43 LOF导致ELK1 3′ UTR延长，转录本稳定性改变并增加蛋白表达。ELK1定位于线粒体，过表达通过开放线粒体通透性转换孔降低细胞活力，且在AD患者脑组织中检测到ELK1水平升高与淀粉样蛋白-β产生增加相关。
*AGRN*：编码集聚蛋白（agrin）的AGRN转录本中出现框内CE，导致隐秘肽的包含。集聚蛋白在NMJ发育中调控乙酰胆碱受体聚集，AGRN突变与先天性肌无力综合征相关。虽然该CE不改变集聚蛋白水平，但可能影响蛋白功能或分泌。
*3.4 TDP-43丧失对神经元兴奋性和传递的影响*
*UNC13A*：UNC13A在大多数谷氨酸能突触中介导囊泡释放。TDP-43耗竭导致UNC13A外显子20和21之间CE包含，显著降低UNC13A蛋白水平。两个单核苷酸多态性rs12973192和rs12608932位于含CE的内含子中，通过改变TDP-43结合增强隐秘剪接但不足以在生理TDP-43水平下诱导CE包含。通过ASO靶向CE或CRISPR-Cas9介导的CE缺失恢复UNC13A蛋白水平可挽救TDP-43耗竭iPSC来源谷氨酸能神经元的突触前缺陷。
*SYT7*：突触结合蛋白7支持海马神经元中突触囊泡的对接和补充。TDP-43耗竭在SYT7外显子3和4之间引入移码CE，使转录本失稳并降低蛋白水平，在ALS-FTD脑额叶皮层及TDP-43 AD病例海马和杏仁核中检出。
*KCNQ2*：编码Kv7电压门控钾通道家族成员。TDP-43丧失导致KCNQ2外显子5跳跃事件，产生缺乏跨膜结构域5和部分孔道形成结构域的KCNQ2ΔE5变体，该变体在内质网积累产生显性负效应，减少M-电流并导致神经元过度兴奋。通过ASO校正KCNQ2异常剪接可挽救此表型。
**四、未来治疗方向**
鉴于核TDP-43清除是约97% ALS和约45% FTD病例的统一标志，隐秘剪接事件的发现为开发早期诊断生物标志物和剪接修饰治疗策略奠定了基础。
*剪接转换ASO和U7 snRNP*：ASO可高特异性结合靶序列，通过RNase H依赖性切割或空间阻断剪接体改变pre-mRNA剪接。靶向UNC13A、STMN2、ATG4B和KCNQ2的ASO已在体外模型中获得剪接校正效果，QRL-201（恢复STMN2水平的ASO）正在临床试验阶段。U7 snRNP通过改造其5′反义序列靶向任何转录本实现剪接调控，可同时包装多种U7 snRNA至同一载体中同时校正多个隐秘事件，且单次给药即可产生终身效应。
*CRISPR相关核酸酶*：dCasRx可用于靶向特定RNA序列调控外显子包含或排除；先导编辑（prime editing）可直接编辑基因组中的隐秘剪接位点。
*广泛恢复TDP-43剪接功能*：表达含TDP-43 RNA结合区和Raver1剪接抑制结构域的嵌合蛋白可避免被已有TDP-43聚集体隔离，在TDP-43耗竭细胞中挽救CE包含。
*剪接门控疗法（TDP-REG系统）*：利用隐秘剪接特异性设计含合成隐秘剪接位点的载体，使转基因仅在TDP-43 LOF细胞中表达。在健康细胞中CE被移除触发NMD降解，在病变细胞中TDP-43功能丧失促进CE包含产生功能性治疗蛋白。该系统已与TDP-43/Raver1嵌合蛋白耦合，特异性在TDP-43缺陷细胞中驱动表达并挽救多重剪接事件，且与腺相关病毒（AAV）包装兼容。
**五、总结与展望**
TDP-43 LOF已被证明先于聚集体形成并可独立重现疾病表型，表明其不仅仅是下游后果，而是驱动导致神经元变性的恶性致病循环的推动因素。虽然导致TDP-43错误定位的上游分子事件尚未完全阐明，但下游后果的识别揭示了TDP-43蛋白病中驱动神经退行性变的关键通路。剪接修饰方法（如ASO和基于U7的治疗）因其在其他神经肌肉疾病中的成功应用而具有吸引力。由于TDP-43调控数千种转录本的加工，校正多重剪接事件可能对实现切实临床获益是必要的。TDP-REG系统可实现在TDP-43核清除细胞中特异性表达治疗性蛋白，将其用于表达不易聚集的TDP-43变体提供了在病变细胞中修复TDP-43丧失所有下游后果的可能性。然而，这是否足以抵消TDP-43 GOF的影响、恢复TDP-43核水平能否重建失去的平衡以抑制进一步聚集、以及是否存在治疗必须在此前施行的关键时间窗口等问题仍有待回答。
