### 罕见病中非编码致病性变异识别的实验与计算方法

《Annual Review of Genomics and Human Genetics》：Experimental and Computational Approaches to Identify Noncoding Pathogenic Variation in Rare Disease

　　

非编码变异发生在非编码基因以及蛋白质编码基因的调控性非翻译区内。重要的是，这些变异已通过多种机制日益被证实与发育性疾病相关。然而，与编码变异相比，非编码变异对转录本或蛋白质丰度的影响尚不明确，因此在临床上仍难以解读。本文回顾了在罕见病中识别致病性非编码变异的方法，这些方法因许多疾病相关组织难以获取而面临挑战。研究人员探讨了高通量功能测定、组学数据整合和长读长测序等实验方法，并综述了用于注释和筛选变异的计算方法，以及预测变异效应和致病性的机器学习方法。研究人员还讨论了最近发现的几种由非编码变异引起的发育综合征，并提出了一种在该患者队列中识别致病性非编码变异的整合方法。

**罕见病非编码致病性变异识别的研究进展——实验与计算方法综述解读**

### 1. 研究背景与存在问题

罕见病预计影响全球3%–5%的人群，其中超过半数患者仍未获得分子诊断。精确的分子诊断不仅能够指导患者治疗、为家庭提供支持，还能为开发新疗法提供生物学线索。然而，截至2020年代初期，由非编码变异导致的罕见病诊断率极低，在已进行基因组研究的患者中，致病性非编码变异的诊断比例不足1%。这一现象部分源于当前临床遗传学仍主要聚焦于可通过三联体氨基酸密码子轻易解释的蛋白质编码变异，而非编码基因组知识的缺乏使得非编码候选变异的临床解读标准化难以实现。值得注意的是，近年研究发现数百名患者携带涉及剪接体的小核RNA（small nuclear RNA, snRNA）基因致病性变异，其中甚至包括此前被认为是假基因的位点；此外，多种非编码RNA类别已被证实与孟德尔疾病相关。这些发现凸显了对非编码RNA变异进行深入靶向研究的必要性。因此，系统梳理当前可用于非编码区域诊断研究的方法，对于提高罕见病的分子诊断率具有重要意义。

### 2. 研究内容与主要结论

该综述系统总结了识别罕见病致病性非编码变异的实验与计算策略，并提出了整合性工作流程。实验方法方面，涵盖基于分子筛选的调控元件鉴定、高通量功能测定（如 massively parallel reporter assays, MPRA；CRISPR编辑）、患者来源组织的多组学整合（转录组学、蛋白质组学、长读长测序与甲基化分析、染色质构象捕获、多组学协同诊断）。计算方法方面，包括注释、过滤、约束与保守性分析，以及基于机器学习的变异功能预测和致病性预测模型。研究得出以下核心结论：单一技术难以全面捕获非编码变异的致病机制，需要结合多种实验与计算手段；RNA-seq可解释约15%的额外诊断率，但受限于组织可及性；长读长基因组测序（long-read genome sequencing, lrGS）在结构变异检测、单倍型分型和甲基化分析中具有独特优势；机器学习模型，尤其是整合3D基因组和表观遗传特征的多模态模型，正逐渐提升非编码变异致病性的预测能力；但现有模型的训练数据偏倚、标签不准确和细胞类型特异性不足等问题仍需解决。通过案例分析（如CHASERR缺失、RNU4-2变异、复杂易位病例），研究人员证明了多组学整合在解决疑难罕见病诊断中的巨大潜力。

### 3. 主要关键技术方法概述

研究人员采用或评估了以下关键技术：①高通量功能实验：MPRA用于评估调控元件的表达影响；CRISPR饱和编辑用于系统测试特定基因或非编码RNA的变异效应。②患者来源样本的多组学分析：对患者诱导多能干细胞分化的神经元（如Undiagnosed Diseases Network的71例患者）进行RNA-seq；对肌肉活检组织（如Cummings和Kremer研究）进行转录组异常检测；利用lrGS同步获得基因组变异和CpG甲基化信息；采用Fiber-seq分析染色质开放性。③计算工具与机器学习模型：包括SpliceAI、Enformer、Sei、FINSURF、ReMM、Genomiser等，以及UTRannotator、MODK等注释工具。④样本队列来源：除上述队列外，还涉及Genomics England测序队列（899例颅神经运动神经元发育障碍患者，以及数千例未确诊罕见病患者）、Deciphering Developmental Disorders队列等。

### 4. 研究结果

**调控元件鉴定与分子筛选**：ENCODE等数据库提供转录、转录因子结合、染色质可及性和组蛋白修饰等多维度注释，有助于解释非编码变异的功能。MPRA可同时检测数万个调控元件，但可能遗漏需要协同作用的增强子-启动子枢纽。CRISPR编辑结合MPRA已成功评估MEF2C附近调控变异的影响。

**功能测定**：一项针对111例综合征性罕见病患者、位于转录起始位点附近的1,958个de novo单核苷酸变异（single-nucleotide variant, SNV）的MPRA实验显示，仅有7个变异（0.36%）显著影响基因表达。

**患者来源组学整合**：转录组学方面，Cummings等和Kremer等利用患者肌肉RNA-seq证实了RNA-seq在无偏发现候选基因方面的价值；整合RNA-seq工具（如FRASER2、OUTRIDER、Differential Expression with DESeq2）可将诊断率提高多达15%。在神经发育疾病中，患者来源神经元分化后的RNA-seq诊断率达25%，其中5例此前的成纤维细胞RNA-seq无法提供信息。RNA-seq还发现RNU4-2相关ReNU综合征的剪接特征：严重患者表现出38%的异常5'剪接位点使用增加。蛋白质组学方面，通过质谱定量证实MRPL38 5'非翻译区（UTR）缺失导致RNA和蛋白水平均显著下调，与另一错义变异形成复合杂合从而确诊。长读长测序与甲基化分析：lrGS可检测更多de novo结构变异（平均3.2个/患者，而短读长测序为0.2个），并同步提供甲基化信息；癫痫队列中，通过差异甲基化分析在582例中识别出12例携带相关变异，其中2例被判定为致病性。染色质构象捕获数据表明，拓扑关联结构域（topologically associating domain, TAD）边界破坏可导致肢体畸形等疾病，但此类变异频率较低。复杂诊断案例中，一例涉及13号和X号染色体的复杂易位需联合lrGS、甲基化、Fiber-seq、lrRNA-seq和染色质构象捕获才能解释多基因调控异常。

**计算方法**：注释工具可整合多种调控特征；过滤数据库（如gnomAD、ClinVar、DECIPHER）有助于筛选候选变异。约束分析显示，致病性非编码变异富集于高约束区域，Gnocchi、JARVIS等工具可量化区域约束。保守性分析（PhastCons、PhyloP、CADD）进一步支持致病性判断。预测模型方面：Enformer等1D模型可预测基因表达，整合3D染色质结构的模型（GraphReg、Orca、ncVarPred-1D3D）性能更优；SpliceAI可精准预测剪接改变；FINSURF和ReMM等随机森林模型用于致病性分类；区域特异性工具如Introme和MirLog专门处理剪接和miRNA变异。多任务模型如AlphaGenome可联合预测多种功能输出，但细胞类型特异性推断可能不准确。模型比较研究显示，现有模型对罕见种系变异（ClinVar）区分良好，但对体细胞和常见变异表现不佳；CAGI挑战中，研究人员在识别致病性错义编码变异方面表现最佳，但在区分功能性非编码变异（eQTL/sQTL）方面表现最差。

**临床应用于发育性疾病**：Genomiser在模拟基因组中将致病性非编码变异排第一名的准确率为77%；Wright等利用UTRannotator在Deciphering Developmental Disorders队列中发现MEF2C和STXBP1的5' UTR致病性de novo变异；Lee等开发单细胞多组学框架，应用于899例颅神经运动神经元发育障碍患者，识别出多个反复突变的增强子；Martin-Geary等在Genomics England队列中通过注释和机器学习评分发现了10个预测有调控效应的de novo变异。

### 5. 总结讨论与结论

讨论部分强调，尽管非编码变异诊断已取得进展，但ClinVar中大多数非编码变异仍为意义不明确变异，且非编码变异的影响仍被低估。每种新组学技术的引入平均能增加约5%的诊断率（范围0.3%–25%），但难以预知哪种数据对特定患者有效。因此，利用预测软件进行初步优先级排序，并指导选择最佳实验验证策略，是解决无候选变异或意义不明确变异患者的有效途径。未来方向是整合大量已有的组学数据和MPRA筛选结果，为“序列-功能”预测模型提供训练数据，同时用于组学特征分类和离群值分析，从而提升从大型全基因组测序队列中优先排序致病变异的能力，并在单患者层面实现高效的正交验证。

**研究结论**：结合实验与计算预测方法，已在多种罕见病中发现致病性非编码变异，其机制包括破坏蛋白质编码基因翻译的调控区域（如MEF2C）、删除非编码RNA（如CHASERR）以及剪接体RNA异常（如RNUs）。随着组学数据公开可用和机器学习性能的迅速提升，研究人员现在能够应用计算方法优先排序潜在致病变异，整合现有组学、CRISPR和MPRA数据进行过滤，并通过患者来源细胞和组织的快速实验测定来验证因果变异，最终提高罕见病的分子诊断率。