α-甘露糖苷酶化学抑制重塑曼氏血吸虫童虫N-糖基化并导致发育异常

《Frontiers in Parasitology》：Chemical inhibition of α-mannosidase in S. mansoni schistosomula leads to reshaped N-glycosylation associated with developmental alterations

　　

血吸虫是一类寄生性扁形动物，全球感染人数超过2.3亿。由于流行区居民持续暴露和高再感染率导致严重疾病，迫切需要能够诱导保护性免疫的预防性疫苗或药物。N-糖基化（N-glycosylation）是真核生物（包括血吸虫）中保守的过程，影响多种细胞和发育生物学过程。血吸虫展示出特征性的发育阶段N-糖链（N-glycans），这些糖链在寄生虫-宿主互作及哺乳动物体内发育中具有重要作用，并伴随N-糖链谱的动态变化。在本研究中，研究人员探讨了在曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）童虫（schistosomula）长期体外培养过程中，应用α-甘露糖苷酶（α-mannosidase）抑制剂kifunensine和swainsonine是否会改变N-糖基化并引起寄生虫发育的表型变化。研究人员首先分析了抑制剂对童虫活力和表型的影响，结果表明这些化合物未引起明显毒性。随后，研究人员检测了六周培养期间童虫的N-糖基化谱。在第一周（W1）内，童虫的N-糖基化发生动态变化，抑制剂暴露导致与对照组显著不同的糖型谱。对照寄生虫以寡甘露糖型（oligomannose, 30%）和复杂型（complex, 60%）N-糖链为特征；kifunensine处理导致寡甘露糖型N-糖链比例升高（72%），特别是M8和M9；swainsonine处理的童虫在化合物处理后第一周以寡甘露糖型（44%）、杂合型（hybrid, 11%）N-糖链以及含单个核心GlcNAc的游离N-糖链（free N-glycans, 16%）为特征。持续处理维持了这些特征性糖型谱，而第一周后停药则使kifunensine组和swainsonine组童虫的N-糖链在第三周恢复至与对照组相似的谱型。值得注意的是，持续kifunensine处理的童虫从第四周起出现局部水肿（oedema），第六周最为显著。然而，第一周后停药未在第四周或之后导致可见表型。总之，长时间的童虫N-糖基化改变导致发育障碍，而仅第一周的短期糖链变化不影响寄生虫正常发育。研究人员的实验数据表明，糖链重塑的活体血吸虫为研究糖链在寄生虫哺乳动物体内发育和存活中的作用提供了一种有吸引力的方法。

**论文解读**

**一、研究背景与问题**

血吸虫病（schistosomiasis）是一种被忽视的热带病，全球感染人数超过2.3亿。血吸虫具有复杂的生命周期，其童虫（schistosomula）在终宿主（人类）体内经历五至七周的发育过程，从幼虫逐步成熟为雌雄成虫，期间伴随显著的形态和分子变化。由于持续暴露和高再感染率，流行区居民罹患严重疾病，而针对血吸虫的 sterilizing immunity（清除性免疫）极为罕见，成虫可在人体内存活数十年。因此，迫切需要开发能够诱导保护性免疫的预防性疫苗或药物。

N-糖基化（N-glycosylation）是存在于包括血吸虫在内的真核生物中的保守过程，影响蛋白质折叠、受体-配体结合等基本生物学功能。血吸虫具有特征性的N-糖链（N-glycans）基序，包括LacdiNAc（LDN）、多岩藻糖基化LDN和LacNAc（LN）等结构。每种血吸虫物种及每个生活史阶段均展现出独特的N-糖基化谱，且童虫在哺乳动物宿主体内迁移和发育过程中，其N-糖链谱持续变化。例如，核心木糖（core-xylose）修饰和岩藻糖基化LacNAc（Lewis X，即Le^X）的丰度逐渐降低，而LDN的丰度逐步升高。此外，N-糖链在寄生虫-宿主互作中发挥关键作用，血吸虫来源的糖链可调控宿主细胞免疫应答或诱导特异性抗体产生。

此前，Kuhlemaijer等研究人员利用两种α-甘露糖苷酶（α-mannosidase）抑制剂——kifunensine（α-甘露糖苷酶I抑制剂，增加高甘露糖型N-糖链）和swainsonine（高尔基体α-甘露糖苷酶II抑制剂，导致杂合型和游离N-糖链积累）——对体外培养的曼氏血吸虫成虫进行了糖链重塑，但未观察到对成虫运动能力和形态的负面影响。然而，考虑到童虫在宿主体内经历广泛的发育过程，且伴随N-糖链谱的动态转变，N-糖基化可能对幼虫发育及其与宿主的相互作用产生重要影响。本研究旨在探究扰乱N-糖基化对曼氏血吸虫童虫体外发育的影响。

**二、研究概况与意义**

研究人员将新鲜转化的曼氏血吸虫童虫在体外长期培养长达六周，模拟其从尾蚴（cercariae）向晚期童虫的成熟过程，同时在培养基中持续添加kifunensine或swainsonine以重塑其N-糖基化。此外，研究人员还设置了一周后停药组以评估N-糖基化谱的恢复能力及由此带来的表型影响。研究结果表明，α-甘露糖苷酶抑制剂未引起即时毒性，但持续kifunensine处理导致童虫从第四周起出现局部水肿（oedema），第六周最为显著。然而，第一周后停药不产生可见的异常表型，且N-糖基化谱在两周内恢复至与对照相似的水平。该研究表明，糖链重塑的活体血吸虫可作为一种功能工具，用于阐明N-糖基化在寄生虫发育和宿主免疫逃逸中的作用，并可能揭示基于糖链的新型药物或疫苗靶点。

**三、关键技术与方法**

研究人员采用了以下主要技术方法开展研究：曼氏血吸虫（波多黎各株）尾蚴通过机械转化获得新鲜童虫，并在改良Basch培养基及长期培养（LTC）培养基中进行体外培养至六周，第一周后添加人红细胞（hRBCs）。化合物筛选采用384孔板高内涵成像平台Roboworm对童虫活力和表型进行自动评分。N-糖链分析采用肽-N-糖苷酶F（PNG-F）释放N-糖链后进行邻氨基苯甲酸（AA）标记，利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行检测，并采用外切糖苷酶（hexosaminidase和β1-4 galactosidase）消化辅助结构鉴定。针对培养基中人血清和红细胞引入的宿主来源N-糖链污染，研究人员建立了基于唾液酸化标志结构的校正方法。蛋白水平的验证采用SDS-PAGE结合Western blot和凝集素印迹（lectin blot），使用Con A（识别高甘露糖型N-糖链）和100-4G11抗体（识别三甘露糖基基序）。表型评估采用明场显微镜和活细胞染料（CellMask Green、CellMask Deep Red和NucBlue）染色后的激光共聚焦显微镜成像。

**四、研究结果**

**α-甘露糖苷酶抑制剂对新鲜转化童虫无即时毒性作用**

研究人员首先通过Roboworm平台评估了kifunensine和swainsonine对新鲜转化童虫的即时毒性。在72小时和120小时的处理后，两种抑制剂处理的童虫在活力和表型评分上与PBS对照组和DMSO阴性对照组聚集一致，而阳性对照（金诺芬和吡喹酮）表现出明显的异常。这表明α-甘露糖苷酶抑制剂在五天体外暴露期间未导致童虫活力下降，适合用于长期培养中的N-糖基化调控研究。

**长期培养中α-甘露糖苷酶抑制引起N-糖链谱改变**

研究人员通过MALDI-TOF MS对六周培养期间的童虫N-糖基化谱进行纵向分析。PBS对照童虫在第一周内呈现快速的N-糖链类型转变：新鲜转化童虫（W0）以复杂型N-糖链为主（中位值84.9%），寡甘露糖型仅占10.5%；至第一周末（W1），复杂型降至59.8%，寡甘露糖型升至30.6%，并出现少量杂合型（2.7%）。此后N-糖链类型趋于稳定，第六周（W6）PBS对照组中复杂型占41.7%，寡甘露糖型占43.3%。

Kifunensine处理在第一周即导致寡甘露糖型N-糖链显著增加至72.2%，复杂型降至21.3%，并在随后五周内寡甘露糖型进一步上升至第六周的93.0%。其中，M9（Man₉GlcNAc₂）和M8（Man₈GlcNAc₂）是kifunensine处理的特征性标志物，M9在第一周即占全部N-糖链的42.8%，至第六周维持在47.4%。

Swainsonine处理在第一周即诱导出独特谱型：GlcNAc1游离N-糖链（FNGs）首次出现（16.4%），杂合型N-糖链占11.4%，寡甘露糖型占44.4%。标志性结构（核心修饰型）M5（Man₅GlcNAc₂）及其岩藻糖基化和木糖基化变体在第一周即出现并持续存在。至第六周，GlcNAc1 FNGs进一步升至25.4%。

停药实验表明，kifunensine组和swainsonine组在停药后N-糖链谱快速恢复，至第三周已与PBS对照组相似，特征性标志物M8/M9和M5在两周内降至对照水平。SDS-PAGE联合Con A和100-4G11抗体的凝集素/免疫印迹分析在糖蛋白水平进一步验证了上述质谱结果：Con A在kifunensine处理组W3和W6样品中检测到更多糖蛋白条带，而100-4G11抗体在swainsonine处理组中识别到25–37 kD区域的强烈糖蛋白条带。

**发育中童虫差异性表达特定N-糖链基序**

在特定N-糖链基序方面，新鲜转化童虫（W0）富含核心木糖（58.4%）和核心岩藻糖（87.1%）修饰的N-糖链，LN基序存在于41.0%的N-糖链上，而LDN基序仅见于2.4%的N-糖链。PBS对照组在培养过程中核心木糖修饰在第三周后降至约1%或更低，核心岩藻糖修饰逐步减少至第四周的44.6%后趋于稳定，LN基序在第六周降至14.4%，而LDN基序持续增加，第六周达31.0%。Kifunensine处理大幅降低了携带核心修饰和LN/LDN基序的N-糖链丰度，这与其复杂型N-糖链的减少一致。Swainsonine对核心修饰总量的影响较小，但核心修饰的载体从对照组的少甘露糖型和复杂型N-糖链转变为杂合型和寡甘露糖型，且LN和LDN基序的丰度受到明显抑制。

**持续抑制α-甘露糖苷酶I在培养中诱发童虫水肿**

在表型层面，明场显微镜观察显示，所有处理组（包括PBS对照）的童虫在第二周均出现生长，形成分叉肠道并含有血红素（hemozoin），类似于早期肝期童虫特征。至第四周，各处理组寄生虫体型增大，口吸盘和腹吸盘清晰可见，出现雌雄异型特征。然而，持续kifunensine处理组从第四周起出现局部水肿表型，表现为虫体局部肿胀变暗，似由血红素积聚所致。定量统计表明，该表型在kifunensine处理组第四周出现于8.2%的童虫中，至第六周升至21.9%，而PBS对照组第六周仅为3.4%，swainsonine组为2.9%。

共聚焦显微镜对活细胞染料（细胞核、肌动蛋白、细胞膜）标记的童虫成像进一步证实了上述发现：kifunensine处理组在第四周可见肠道局部的暗色中断区域，swainsonine处理组亦出现肠道组织紊乱的迹象，而PBS对照组发育正常。在停药组中，无论明场显微镜还是共聚焦显微镜观察，均未发现上述水肿表型。这表明仅在第一周进行糖链改变不足以诱导异常发育表型，持续的糖基化改变是导致发育障碍的必要条件。

**五、讨论与结论**

本研究证实，通过kifunensine和swainsonine抑制α-甘露糖苷酶可有效重塑活体曼氏血吸虫童虫的N-糖基化谱。PBS对照组在体外培养中展现的N-糖基化谱与已发表的体内发育数据总体一致，表现为LDN基序持续增加、核心木糖修饰消失和核心岩藻糖修饰减少的趋势，表明体外培养体系可较好模拟体内N-糖基化的成熟过程。抑制剂诱导的N-糖链变化模式与此前在成虫中的观察相似，其中swainsonine产生的GlcNAc1 FNGs是一个显著特征，此前在哺乳动物细胞中被归因于胞质α-甘露糖苷酶的抑制。

关于持续kifunensine处理所导致的局部水肿表型的潜在机制，研究人员提出两种可能解释。其一，“细胞粘附假说”：N-糖链可影响E-cadherin（E-钙黏蛋白）介导的细胞间粘附功能以及integrin（整合素）介导的细胞-细胞外基质粘附，糖基化的改变可能导致肠道组织细胞连接的削弱。其二，“消化功能假说”：已有研究表明肠道上皮细胞的N-糖基化影响肠道形态和氨基酸消化功能，且哺乳动物肠上皮细胞体外分化伴随N-糖链由高甘露糖型向复杂型转变以及高尔基体α-甘露糖苷酶的上调，因此α-甘露糖苷酶抑制可能通过干扰肠道细胞分化而导致组织紊乱。

本研究的一个重要发现是N-糖基化谱在停药后的快速恢复能力：停药两周内糖型谱即恢复至与对照相似水平，且无异常表型出现。这表明持续的糖基化扰动是导致发育缺陷的必要条件，也意味着α-甘露糖苷酶抑制剂在体内研究或长期共培养实验中的应用存在局限性。为此，研究人员提出未来可采用RNA干扰（RNAi）技术敲低N-糖基化通路中关键酶的表达，或通过CRISPR基因组编辑技术创建具有永久性N-糖链谱改变的寄生虫株，甚至通过引入新的糖基化酶基因实现特定糖链基序的过表达，从而实现更持久的糖链重塑，以便在宿主样环境中开展功能性研究。

此外，研究人员也讨论了来源于培养基中人血清和人红细胞的宿主N-糖链可能带来的污染问题。本研究采用基于唾液酸化标志结构的校正方法，对不同处理组之间的宿主N-糖链贡献进行了系统的扣除处理。由于培养基中不存在活性N-糖基化机制且所有处理组接受相同校正流程，该校正方法为不同处理条件之间的糖型比较提供了可靠保障。

综上所述，本研究得出以下研究结论：通过kifunensine或swainsonine抑制α-甘露糖苷酶可有效重塑活体童虫的N-糖基化，产生具有特征性N-糖链谱的寄生虫；kifunensine介导的糖链重塑以局部水肿的形式影响寄生虫发育，而两种化合物均未表现出即时毒性；第一周后停药可使N-糖基化和发育完全恢复至正常，从而避免发育异常表型的出现。该研究证实了N-糖基化在童虫体外成熟过程中是一个动态过程，可被调控以产生糖链重塑的寄生虫。在未来的研究中，糖链调控方法可用于研究糖链在寄生虫哺乳动物体内发育和存活中的贡献，从而揭示血吸虫病及其他被忽视热带病新型防控策略的潜在靶点。