二陈汤多糖（PECD）的胃肠道命运、肠道菌群调控及代谢组学研究

《Frontiers in Microbiology》：Polysaccharides from Er Chen Decoction: gastrointestinal fate, gut microbiota modulation and metabolomics

　　

背景：二陈汤（Er Chen Decoction, ECD）是治疗痰证（phlegm-related disorders）的经典方剂，其中多糖组分（polysaccharides from ECD, PECD）是重要的生物活性部位（bioactive fraction）。本研究系统评估了PECD的胃肠道吸收、消化稳定性、粪便发酵特性及其与肠道菌群和代谢变化的相关性。方法：采用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的多糖进行荧光示踪，评价PECD的体内胃肠道吸收。通过测定总糖/还原糖含量、分子量分布、单糖组成和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectra, FT-IR），评估PECD在模拟口腔、胃和肠道消化过程中的稳定性。随后，通过检测pH值、短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）、16S rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics），对PECD的体外粪便发酵进行评价。结果：胃肠道给药后，未检测到FITC标记PECD的明显全身吸收。在模拟消化过程中，PECD的总糖和还原糖含量、分子量分布、单糖组成和红外光谱特征均未发生显著变化，提示其主要多糖组分在很大程度上抵抗上消化道消化。在体外粪便发酵过程中，PECD逐渐被肠道菌群利用，伴随pH值降低和SCFAs浓度升高。PECD补充还与微生物群落组成的改变相关，表现为富集双歧杆菌属（*Bifidobacterium*）和光岗菌属（*Mitsuokella*）等菌属，同时减少克雷伯菌属（*Klebsiella*）和嗜胆菌属（*Bilophila*）等其他菌属。非靶向代谢组学分析揭示了与苯丙氨酸代谢（phenylalanine metabolism）、咖啡因代谢（caffeine metabolism）和精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）相关的代谢物变化，提示这些通路可能参与微生物对PECD的响应。结论：PECD表现出有限的吸收、抵抗上消化道消化、易被粪便微生物发酵，并改变了微生物组成、SCFAs和代谢谱，这支持其作为候选生物活性多糖的进一步研究。

**论文解读**

**研究背景与意义**

二陈汤（Er Chen Decoction, ECD）是中医治疗痰证（phlegm syndrome）的经典方剂，其来源可追溯至宋代编撰的《太平惠民和剂局方》。ECD由六味药材组成：清半夏（Qingbanxia）、陈皮（Chenpi）、茯苓（Fuling）、炙甘草（Zhigancao）、乌梅（Wumei）和生姜（Shengjiang），传统用于燥湿化痰、理气和中。临床研究表明，ECD对支气管哮喘的总体有效率达95.3%，并可改善机体免疫调节功能；另一项纳入438例受试者的随机试验显示，ECD作为肥胖辅助治疗可促进临床恢复并减轻多种代谢危险因素。已有研究表明，许多中药来源的多糖可安全有效地治疗肺部疾病和代谢紊乱，但目前多数关注集中于单味药材的多糖，而对复方来源多糖的研究有限。

现有证据表明，相对于单一活性多糖，复方多糖（compound polysaccharides）在免疫调节等生物活性方面表现出更优的强度和广度。例如，含姬松茸（*Agaricus blazei* Murrill）、灰树花（*Grifola frondosa*）和陈皮（*Pericarpium Citri Reticulatae*）的多糖配方显示出增强的抗肿瘤活性。更重要的是，复方多糖是通过多味药材共煎共提（co-decoction and co-extraction）获得，这一过程可能引发分子间相互作用、结构重排及新型复合物的形成，这些是单味药材提取物中所不具备的。因此，复方来源多糖的消化行为、微生物发酵性和生物活性不能简单从单味药材多糖推导。尽管ECD方中各单味药材的多糖已有报道，但针对全方多糖组分（PECD）的系统研究尚属空白，而研究全方多糖在临床上更具相关性，因其反映了中医实际用药中多药配伍的特点。此外，肠道菌群失调与炎症、代谢和免疫相关疾病的发病机制密切相关，多糖可通过促进有益菌生长、抑制致病菌及调节微生物群落组成来维持肠道稳态。因此，系统研究PECD的胃肠道消化稳定性、微生物发酵性和代谢产物谱，对于阐明其肠道菌群调控潜力至关重要。

**关键技术方法**

研究人员采用FITC标记PECD并进行昆明（Kunming, KM）小鼠灌胃给药，通过体内荧光成像动态追踪PECD在胃肠道及主要器官的分布。体外模拟消化采用三步连续模型（口腔、胃、小肠），通过测定总糖/还原糖含量、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）分子量分布、PMP柱前衍生化UHPLC单糖组成分析和FT-IR光谱，评估PECD在消化各阶段的稳定性。体外粪便发酵使用来自六名健康成人（20–30岁，男女各三人）的混合粪便接种物，以低聚果糖（fructooligosaccharides, FOS）为阳性对照，在严格厌氧条件下进行48小时分批发酵，监测pH变化、碳水化合物消耗、SCFAs产量及多糖结构变化。肠道菌群分析采用16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序，代谢组学分析采用UPLC-Q Exactive HF-X Orbitrap高分辨质谱系统进行非靶向代谢物注释，并结合PCA和OPLS-DA进行多元统计分析。Spearman相关性分析用于评估差异微生物类群与差异代谢物之间的关联。

**研究结果**

**体内动态分布：** 口服灌胃后，FITC标记PECD的荧光信号主要局限于小鼠胃肠道内。离体器官荧光成像显示，肺、脾、肝、肾等重要器官中未观察到明显荧光信号。小肠信号强度在给药后1小时达峰后下降，而盲肠和结肠区域信号随时间逐渐增强，约4小时达到最大值。这些结果表明PECD基本上不被全身吸收。

**体外模拟消化稳定性：** 在模拟唾液消化阶段，PECD的总糖含量（从2,091.4 ± 21.48至2,077.42 ± 17.07 μg/mL）和还原糖含量（从0.168 ± 0.007至0.160 ± 0.033 mg/mL）均无显著变化（p > 0.05），HPGPC色谱图保留时间基本不变，未检测到游离单糖，表明PECD对唾液α-淀粉酶具有稳定性。在模拟胃液消化阶段，总糖和还原糖含量同样无显著变化，HPGPC洗脱谱和单糖组成保持稳定，表明PECD抵抗胃酸和胃蛋白酶的降解。在模拟小肠消化阶段，PECD的总糖含量（从459.14 ± 30.66至464.19 ± 16.52 μg/mL）和还原糖含量（从1.619 ± 0.036至1.532 ± 0.075 mg/mL）保持稳定（p > 0.05），分子量分布和单糖组成未见明显变化，表明PECD抵抗肠道水解酶的酶解作用。FT-IR光谱进一步证实，在整个模拟消化过程中，PECD保留了多糖的特征吸收带，主要官能团和糖苷骨架基本保存完好。

**体外发酵特征：** PECD发酵液在0–6小时期间出现最快速的pH下降，之后趋于稳定（从6.87降至4.63），而FOS组在整个48小时持续下降（从7.23降至4.41）。碳水化合物残余率分析显示，PECD组在48小时发酵后的总碳水化合物消耗率达66.52%，低于FOS组的92.54%，表明PECD具有较低的发酵速率或较高的微生物降解抗性。还原糖含量从基础的1.41 ± 0.01 mg/mL下降至12小时的0.79 ± 0.01 mg/mL，随后基本不变。HPGPC分析显示，随发酵进行，PECD主峰逐渐向更长保留时间偏移并伴随峰展宽和分裂，48小时后原有高分子量峰几乎消失，表明PECD发生渐进式解聚。游离葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）的特征峰在发酵6小时后消失。FT-IR光谱中1,741 cm^?1处酯化羰基峰的逐渐减弱，提示高度酯化果胶结构域的降解。

**微生物组分析：** 与空白48 h组相比，PECD 48 h组的Chao1、Shannon和Simpson指数均显著降低（p < 0.05至p < 0.001），提示PECD主要通过底物特异性富集响应微生物而引起群落生态重构。PCoA分析显示，PECD 48 h组与其他组分离最为明显，表明其诱导了最强的群落迁移。在门水平上，PECD组放线菌门（Actinomycetota）丰度显著升高（10.28% vs. 空白48 h组的0.88%，p < 0.05）。在科水平上，PECD显著提高双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）的相对丰度（9.53% vs. 空白48 h组的0.44%，p < 0.05）。在属水平上，PECD显著富集双歧杆菌属（*Bifidobacterium*，从0.44%升至9.54%，p < 0.05）和光岗菌属（*Mitsuokella*，从0.30%升至4.74%，p < 0.001），同时显著减少克雷伯菌属（*Klebsiella*，从33.23%降至3.81%，p < 0.001）和嗜胆菌属（*Bilophila*，p < 0.001）。PECD未显著富集巨单胞菌属（*Megamonas*）或月形单胞菌科（Selenomonadaceae），这与FOS的效应形成明显差异，反映了两种底物不同的结构选择性发酵特征。

**SCFAs变化：** PECD组的总SCFAs浓度呈现持续稳定的升高模式，从起始的22.63 ± 5.84 mmol/L逐渐升至48小时的34.09 ± 1.44 mmol/L。与空白组相比，PECD组发酵48小时后乙酸（4.0倍）和丁酸（8.6倍）水平均显著升高（p < 0.05）。与FOS组快速产酸模式不同，PECD表现出较缓慢但持续的SCFAs生成动力学。

**非靶向代谢组学分析：** PCA和OPLS-DA分析显示Blank组与PECD组之间存在明显的代谢特征分离（正离子模式Q² = 0.922，负离子模式Q² = 0.938）。共鉴定出1,597种显著差异代谢物（691种上调，906种下调）。通路分析表明，影响最显著的通路为苯丙氨酸代谢、咖啡因代谢和精氨酸生物合成（Impact值 > 0.20）。其中，1-甲基黄嘌呤、N-乙酰鸟氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸和苯乙醛在PECD组中上调，而7-甲基尿酸和苯乙胺下调。Spearman相关性分析表明，这些代谢物与埃希菌属（*Escherichia*）、双歧杆菌属（*Bifidobacterium*）和光岗菌属（*Mitsuokella*）呈显著正相关，而与克雷伯菌属（*Klebsiella*）和嗜胆菌属（*Bilophila*）呈显著负相关。

**讨论与结论**

PECD在模拟上消化道消化过程中表现出高度稳定性，其主要多糖组分能抵抗唾液酶、胃酸和肠道消化液的水解作用，这与其复杂的单糖组成、结构异质性、不能被宿主消化酶识别的糖苷键以及相对有限的酶可及性有关。PACE分析表明PECD可能含有富含半乳糖醛酸（GalA）的类果胶结构域及中性糖侧链。在体外发酵中，PECD表现出较FOS更缓慢但持续的发酵和SCFAs生成动力学，这可能反映了其结构复杂性需要更广泛的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes）库和多种微生物类群的协同作用。微生物群落方面，PECD富集了双歧杆菌属和光岗菌属等有益菌群，同时抑制了克雷伯菌属和嗜胆菌属等潜在有害菌群。代谢组学揭示的苯丙氨酸代谢、咖啡因代谢和精氨酸生物合成三条通路，既往研究表明它们与免疫稳态调控、气道炎症状态及氧化还原平衡密切相关，提示PECD可能通过这些通路参与炎症稳态调节。然而，这些结果来源于体外封闭系统，需在疾病模型中进一步验证。

**研究结论：** 综上所述，PECD表现出对模拟上消化道消化的显著抵抗性，并在体外粪便发酵中经历渐进式、不完全的解聚。与FOS相比，PECD展现更缓慢而持续的发酵、延长的SCFAs生成以及独特的微生物群落重构模式。这些特征可能与其异质性结构和需要多种微生物利用通路有关。PECD发酵与双歧杆菌属、光岗菌属、克雷伯菌属、嗜胆菌属和埃希菌属等菌属相对丰度的变化以及整体微生物群落结构和代谢物谱的改变相关。基于目前已有证据，PECD更适合被描述为具有消化抵抗性、可发酵性和菌群调控潜力的富含多糖的部位。这些初步观察初步提示PECD可能发挥菌群介导的效应，这鼓励研究人员进一步探索其作为候选生物活性多糖的潜力，尽管还需要额外的体内研究来证实这些发现。