《Frontiers in Bioinformatics》：Rational discovery of peptide inhibitors targeting Keap1: a focus on neurodegenerative diseases
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引言：Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）通路是神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases, NDDs）中一个有前景的治疗靶点。Nrf2的激活通过增强抗氧化防御、抑制神经炎症、改善线粒体
引言：Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）通路是神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases, NDDs）中一个有前景的治疗靶点。Nrf2的激活通过增强抗氧化防御、抑制神经炎症、改善线粒体功能、抑制铁死亡（ferroptosis）以及维持蛋白质稳态，从而减轻NDDs中的关键致病机制。目的：通过理性计算方法（rational computational approach）设计和鉴定能够破坏Keap1/Nrf2相互作用的肽类抑制剂。方法：从Nrf2来源的模板肽出发，生成包含13167条肽的组合肽库，并根据预测的血脑屏障通透性、毒性、致敏性、抗氧化和抗炎潜力以及理化性质进行严格的多层级筛选。经过全面的安全性评估后，11条有前景的肽被列入候选名单，并采用分子对接、MM-GBSA（分子力学/广义Born表面积）结合自由能计算以及残基级能量分解分析进行评估。随后对排名靠前的肽候选物进行200 ns分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，通过结构稳定性、柔性、主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、氢键占据率和自由能景观（Free Energy Landscape, FEL）分析来评估复合物的稳定性和结合行为。结果：在候选肽中，LMEETYEFL（pep4369）和LDYETYEFL（pep6649）在对接和MM-GBSA分析中表现出比模板肽更强的Keap1结合亲和力。MD模拟证实了肽-Keap1复合物在整个模拟过程中的结构稳定性和良好的构象行为。结论：这些发现表明LMEETYEFL和LDYETYEFL是破坏Keap1/Nrf2相互作用的有前景的候选分子。然而，仍需实验验证以确认其治疗潜力并推动进一步的生物学评价。
**论文解读**
**一、研究背景与目的**
神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases, NDDs）是一组涉及神经系统不同区域进行性神经元丧失的异质性神经疾病，可导致认知、行为和运动功能障碍，主要包括阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）、帕金森病（Parkinson's Disease, PD）、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）、多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）和亨廷顿病（Huntington's Disease, HD）。这些疾病的共同病理特征包括氧化应激、蛋白质错误折叠、神经炎症、铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式）以及线粒体功能障碍，给全球带来了巨大的医疗、社会和经济负担。
核因子红细胞2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2, Nrf2）是调控细胞抵抗氧化和毒性应激的关键转录因子。在生理条件下，Nrf2被Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-Associated Protein 1, Keap1）持续降解；而在氧化应激条件下，Nrf2逃脱Keap1介导的降解，转位至细胞核，激活抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element, ARE）依赖的细胞保护和解毒基因。Nrf2的激活可增强抗氧化防御、抑制炎症、维持蛋白质稳态、支持线粒体功能并抑制铁死亡。在NDDs中，Nrf2活性受损与炎症加剧、氧化失衡和蛋白毒性应激密切相关，因此靶向Nrf2激活已成为NDDs的一种潜在治疗策略。
目前，临床上已有共价Nrf2激活剂如富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, Tecfidera）和富马酸地罗西梅尔（diroximel fumarate, Vumerity）用于MS的治疗，但这些药物可能面临脱靶效应、毒性和药代动力学等方面的挑战。此外，迄今尚无非共价Keap1抑制剂进入临床试验阶段。Nrf2来源的基于DLG和ETGE基序的肽类抑制剂已被研究作为Keap1-Nrf2相互作用的调节剂，但其细胞通透性有限仍是主要障碍。因此，对基于ETGE基序的肽进行理性优化，有望为开发改进的Keap1靶向抑制剂提供潜在策略。在此背景下，研究人员采用了一种整合计算策略，结合肽性质筛选、分子对接、MM-GBSA分析和分子动力学模拟，以鉴定靶向Keap1-Nrf2相互作用的肽候选物。
**二、主要技术方法概述**
研究人员以Nrf2来源的肽LDEETGEFL为模板，利用PepCoGen服务器通过单位点和双位点氨基酸替换生成了包含13167条肽的组合肽库。随后依次利用BBPpredict预测血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）通透性，利用ToxinPred 3.0评估毒性，利用AllerCatPro 2.0评估致敏性，利用PreTP-Stack预测抗炎潜力，利用AnOxPePred 1.0评估抗氧化活性，利用HemoPI2评估溶血活性，利用PLifePred和HLP预测肽在血液和肠道中的半衰期，利用PASTA 2.0评估聚集倾向，并利用ExPASy ProtParam和Innovagen PepCalc计算理化性质。经多层级筛选后，11条肽进入后续评估。利用PEP-FOLD4进行肽三维结构建模，以Keap1 Kelch结构域晶体结构（PDB ID: 2FLU，分辨率1.50 ?）为靶蛋白，采用HPEPDOCK 2.0进行肽-蛋白对接，利用HawkDock V2进行MM-GBSA结合自由能计算和残基级能量分解分析，最后采用GROMACS 2023.3在OPLS力场和SPC/E水模型下对排名靠前的肽-Keap1复合物进行200 ns分子动力学模拟。
**三、研究结果**
**（一）新型Keap1靶向肽的计算设计**
Keap1与Nrf2之间的相互作用主要通过Keap1的Kelch结构域介导，该结构域包含五个极性亚口袋（P1-P5）。Nrf2的Glu79与P1亚口袋结合，Glu82与P2相互作用，Tyr334、Asn382、Gln530、Ser555和Ser602等残基通过氢键、范德华力和水介导相互作用进一步稳定ETGE基序的结合。因此，靶向Keap1 Kelch结构域的ETGE结合区域是破坏Keap1/Nrf2相互作用的合理策略。研究人员选择Nrf2来源的肽LDEETGEFL（L76-L84）作为模板序列，通过单位点和双位点氨基酸替换生成了包含13167条肽的虚拟肽库（编号pep1至pep13167），并实施了系统的计算筛选策略。
**（二）潜在治疗性肽抑制剂的筛选**
在BBB通透性和安全性评估中，13167条设计肽中有756条被预测具有BBB穿透潜力，其中459条被归类为无毒且无致敏性。进一步利用PreTP-Stack评估抗炎潜力，其中150条被预测为抗炎肽（Anti-Inflammatory Peptide, AIP）。利用AnOxPePred 1.0评估抗氧化潜力，以自由基清除（Free Radical Scavenging, FRS）评分阈值0.5为标准，鉴定出29条具有抗氧化潜力的肽（FRS值为0.501–0.596，金属离子螯合CHEL评分为0.201–0.290）。
在溶血性、稳定性和聚集倾向评估中，HemoPI2预测全部29条肽均无溶血性（半数溶血浓度HC
50 > 100 μM）。HLP分析表明28条肽的预测肠道半衰期超过1.0秒，PLifePred预测26条肽的血浆半衰期超过800秒。PASTA 2.0分析显示所有29条肽均具有高度内在无序性且无自聚集倾向区域。综合评估后，26条肽满足所有筛选标准并进入理化性质分析。
在理化性质评估中，研究人员计算了不稳定性指数、脂肪族指数、GRAVY（总平均亲水性）、等电点（pI）、分子量和溶解度。综合理化参数分析后，pep3799、pep4369、pep4720、pep6288、pep6649、pep8094、pep8264、pep8454、pep10259、pep11142和pep11323共11条肽被列为最优候选物。
**（三）设计肽的稳定性和结合亲和力评估**
PEP-FOLD4预测的肽三维模型sOPEP能量值范围为?15.38至?11.25 kcal/mol，表明所有肽均采用能量有利的构象。HPEPDOCK 2.0对接结果显示，模板肽的对接评分为?195.149 kcal/mol，而所有筛选肽均表现出更强的结合亲和力（?215.415至?239.443 kcal/mol）。对接协议验证中，重对接肽与实验结构的骨架RMSD为1.581 ?（低于2 ?），证实了对接协议的可靠性。MM-GBSA分析显示，pep4369（?87.34 kcal/mol）和pep6649（?86.03 kcal/mol）表现出比模板肽（?62.7 kcal/mol）更有利的结合自由能。残基级能量分解分析表明，Keap1关键极性口袋残基Arg415、Arg380、Arg483、Ser508和Tyr334、Tyr572在稳定肽结合中发挥核心作用，其中Arg415在pep4369复合物中贡献了最有利的能量值（?13.43 kcal/mol）。
**（四）分子间相互作用分析**
模板肽在Keap1结合口袋内形成7个氢键（涉及Arg380、Asp389、Asn414、Ser431、Arg483和Ser555）、疏水相互作用（Tyr334、Phe478、Tyr572和Phe577）、盐桥（Arg380、Arg415、His436）以及π-π堆积相互作用（Tyr572）。pep4369（LMEETYEFL）形成了更广泛的相互作用网络，包括10个氢键（Tyr334、Arg380、Asn382、Asn414、Arg415、Ser431、Arg483、Ser508）、疏水相互作用（Ile461、Phe478、Ala556、Phe577）和盐桥（Arg380）。pep6649（LDYETYEFL）形成了9个氢键（Tyr334、Arg380、Asn382、Pro384、Arg483、Gln530、Ser555）、疏水接触（Tyr334、Tyr525、Tyr572、Phe577）、π-堆积相互作用（Tyr334、Tyr572）和盐桥（Arg380）。PEPMatch分析表明，两条先导肽均与Nrf2（NFE2L2，UniProt ID: Q16236.3）的天然Keap1结合区域具有序列相似性。
**（五）肽-Keap1复合物在动态生物环境中的稳定性评估**
200 ns MD模拟中，所有复合物的RMSD值均保持在0.28 nm以下。Keap1-pep4369和Keap1-pep6649复合物的平均RMSD值分别为约0.110 nm和0.105 nm，显著低于Keap1-模板复合物（约0.211 nm），表明构象稳定性更高。RMSF分析显示，pep4369和pep6649复合物在关键结合位点残基（Arg380、Arg415、Arg483、Ser363、Ser508、Ser555、Ser602、Asn382、Tyr334、Gln530）处的波动显著低于模板复合物。回旋半径（R
g）分析显示，Keap1-pep4369复合物的R
g分布更窄更低（1.69–1.74 nm），表明其构象更紧凑。SASA分析表明所有复合物在模拟期间均维持稳定的溶剂暴露特征。PCA二维投影显示，pep4369和pep6649复合物的运动模式更紧凑且聚类良好，表明与这些肽结合增强了结构稳定性。
氢键分析显示，Keap1-pep4369复合物在整个模拟过程中维持了最高的分子间氢键数量（平均约9个），而Keap1-pep6649复合物平均维持约6个，模板肽仅约5个。氢键占据率分析进一步揭示，pep4369中Arg483-Leu9的占据率达88.28%和80.00%，pep6649中Asn382-Glu4的占据率达97.26%，Tyr6-Asn414达89.09%，表明关键接触的高度持续性。自由能景观（FEL）分析显示，Keap1-pep4369复合物呈现深而窄的能量盆地，Keap1-pep6649呈现两个紧密相邻的能量盆地，而模板复合物则呈现更宽浅的能量盆地，表明设计肽与Keap1的结合亲和力更强。
**（六）构象分析和MM-GBSA验证**
时间依赖性构象快照（0 ns、50 ns、100 ns、150 ns、200 ns）显示，pep4369和pep6649在整个200 ns模拟中始终良好地容纳于Keap1 Kelch结合口袋内，保持紧凑的结合取向。基于最后10 ns MD轨迹的MM-GBSA计算进一步支持了MD模拟结果：Keap1-pep6649复合物的结合自由能最为有利（?80.99 kcal/mol），其次为Keap1-pep4369（?69.12 kcal/mol），均优于模板肽（?52.55 kcal/mol）。残基级能量分解再次确认Arg415、Arg483和Arg380是所有三个复合物中肽结合的主要贡献残基。
**四、讨论总结与研究结论**
综上所述，研究人员通过理性计算设计和多步筛选策略，从13167条候选肽中成功鉴定出两条先导肽LMEETYEFL（pep4369）和LDYETYEFL（pep6649）作为有前景的Keap1候选抑制剂。这两条肽在分子对接、MM-GBSA结合自由能计算和残基级能量贡献分析中均表现出优于模板肽的Keap1结合能力。200 ns MD模拟进一步验证了肽-Keap1复合物的结构稳定性，RMSD值稳定、残基水平波动低、氢键网络持续、自由能景观呈现有利构象状态。Arg415、Arg483和Arg380被确认为维持Keap1-肽结合相互作用的关键热点残基。
研究结论（原文Conclusion翻译）：研究人员的理性计算设计和多步筛选策略成功鉴定了两条先导肽LMEETYEFL（pep4369）和LDYETYEFL（pep6649），作为有前景的Keap1候选抑制剂。所选肽表现出良好的预测药理和理化性质，包括BBB通透性、无毒性、无致敏性、无溶血行为以及预测的抗氧化和抗炎活性。分子对接、结合自由能计算和残基级能量贡献分析支持了其在Keap1结合口袋内的有利结合。此外，通过MD模拟评估的动态行为表明蛋白质-肽复合物稳定，表现为一致的RMSD值和整个模拟过程中较低的残基水平波动。FEL分析进一步支持了能量有利构象状态的存在。氢键占据率、构象分析和基于MD的残基级分解分析突出了Arg415、Arg483和Arg380在维持Keap1-肽结合相互作用中的关键贡献。总体而言，这些发现支持了LMEETYEFL和LDYETYEFL作为候选Keap1抑制剂的潜力。虽然还需要实验验证来确认其生物学效力和特异性，但这些发现为开发靶向Keap1的肽类治疗药物用于NDDs的治疗提供了一个有前景的框架。
