《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Activated platelet rich plasma modulates the proliferation, apoptosis and matrix synthesis driven by growth factors in osteoarthritic chondrocytes: an in vitro study
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摘要
引言： 激活的血小板富集血浆（activated platelet-rich plasma, aPRP）可减轻骨关节炎膝关节的炎症并促进再生。与健康软骨细胞（healthy chondrocytes, HCs）相比，aPRP可能通过调节细胞内信号通路，促
摘要
引言： 激活的血小板富集血浆（activated platelet-rich plasma, aPRP）可减轻骨关节炎膝关节的炎症并促进再生。与健康软骨细胞（healthy chondrocytes, HCs）相比，aPRP可能通过调节细胞内信号通路，促进细胞增殖、减少自噬相关囊泡并抑制凋亡，从而对骨关节炎软骨细胞（osteoarthritic chondrocytes, OACs）发挥治疗作用。因此，本研究旨在评估HCs和OACs中的细胞活力、凋亡命运、细胞外基质蛋白表达（II型胶原（COL2A1）和聚集蛋白聚糖（ACAN））、自噬相关囊泡产生以及生长因子谱，包括转化生长因子-β（TGF-β）和血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）。
方法： 研究人员使用微珠机械激活制备aPRP-S和PRP-G，并制备富含白细胞的L-PRP、贫白细胞P-PRP以及富含生长因子的血小板（platelet-rich in growth factors, PRGF），将其与HCs和OACs共培养，进行实时增殖分析、通过流式细胞术检测凋亡、通过免疫荧光标记检测自噬及相关细胞内标志物，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析分泌蛋白组谱，同时确定其有效剂量（ED50）和最佳ED50时间点。
结果： 2.7%浓度的aPRPs在2小时及1.8%浓度的PRGF在3小时可诱导OACs增殖。PRGF降低了OACs的凋亡细胞比例。aPRPs和PRGF促进了COL2A1和ACAN蛋白的合成。
讨论： 诱导OACs增殖是一项有望转化为临床应用的结果。aPRPs可能对OACs具有刺激作用，且该作用可能依赖于剂量和制备方案。aPRPs和PRGF可优选用于刺激培养的OACs中COL2A1的合成并降低凋亡细胞比例。
论文解读：激活的血小板富集血浆对骨关节炎软骨细胞的调控作用
一、研究背景与目的
骨关节炎（osteoarthritis, OA）是最常见的关节炎形式，全球约有5亿人受累。该疾病通过关节软骨、软骨下骨及周围组织的炎症、退变和修复循环而进展，尤其在关节过度负荷的情况下，如家族性多基因遗传易感性或高体重指数。随着超重和肥胖率的上升，OA的发病风险持续增加。目前的一线非手术治疗包括患者教育、结构化锻炼、体重管理及药物支持，但缺乏能够有效逆转或修复软骨退变的疾病修饰疗法。因此，迫切需要创新的再生疗法。
血小板富集血浆（platelet-rich plasma, PRP）作为一种有前景的再生方法，在非手术和疾病修饰方法失败时，可缓解早中期膝OA的症状。不同PRP制剂在浓度和激活技术上存在差异，其含有丰富的血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）、转化生长因子β（TGF-β）及血管生成生长因子等，具有抗炎、促进组织再生、软骨形成和细胞增殖的能力。既往代谢组学分析显示，不同PRP制剂在炎症信号、氧化还原稳态、类固醇代谢、能量产生和血小板活化等方面存在显著代谢差异，制备方案决定了PRP的生化特征，凸显了PRP制备标准化的紧迫性。
本研究假设，使用微珠机械激活的PRP（aPRP）制剂在优化剂量和时间后，将比其他PRP制剂对OA软骨细胞（OACs）和健康软骨细胞（HCs）表现出更优的治疗效果，具体通过调节细胞增殖、自噬和凋亡实现。研究旨在阐明不同aPRP制剂（特别是aPRP-S和PRP-G）、L-PRP、P-PRP和富含生长因子的血小板（PRGF）对HCs和OACs细胞活力、凋亡命运、细胞外基质蛋白表达（COL2A1和ACAN）、自噬相关囊泡形成及生长因子谱（TGF-β和PDGF-BB）的调节作用，并确定最有效PRP制剂的有效剂量（ED50）和最佳时间点。
二、主要技术方法
本研究为一项前瞻性对照体外细胞培养研究，经Hacettepe大学非侵入性临床研究伦理委员会批准。研究纳入6名18–24岁健康不吸烟男性志愿者（平均年龄22.0 ± 1.7岁，BMI 26.0 ± 5.0 kg/m2），使用五种商用试剂盒制备PRP（aPRP-S、aPRP-G、P-PRP、L-PRP和PRGF）。人OA软骨细胞（#402OA-05a）和健康软骨细胞（#402-05a）购自美国Cell Applications公司。主要技术方法包括：采用xCELLigence实时阻抗系统进行细胞增殖分析和ED50计算；使用自噬检测试剂盒（ab139484）结合免疫荧光显微镜评估自噬相关囊泡；采用Annexin-V/碘化丙啶（PI）标记结合流式细胞术（FCM）检测凋亡；通过免疫荧光（IF）评估COL2A1和ACAN表达；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1和PDGF-BB分泌水平。
三、研究结果
3.1 aPRP、L-PRP和PRGF在较低剂量和更短时间内诱导OACs增殖
HCs和OACs呈梭形、纺锤形形态，高贴壁且增殖能力强。在前10小时内，aPRP-S、PRGF和L-PRP相比内部对照增加了HCs和OACs的增殖。aPRP-G和P-PRP未表现出显著的细胞增殖效果。aPRP-S在HCs中的ED50和有效时间点为2.7%和5小时（R2 = 1），在OACs中为2.2%和2小时（R2 = 1）。PRGF在HCs中的ED50和有效时间点为1.8%和3小时（R2 = 0.99），在OACs中为1.6%和3小时（R2 = 0.97）。L-PRP在HCs中的ED50和有效时间点为4.3%和4小时（R2 = 0.98），在OACs中为3.0%和3小时（R2 = 1）。aPRP和PRGF在OACs和HCs上表现出更好的治疗窗口，被选用于后续功能分析。
3.2 PRGF处理的OACs促进自噬相关囊泡，而aPRP在HCs和OACs中诱导相似的囊泡形成
经2.7% aPRP处理2小时或1.8% PRGF处理3小时的HCs和OACs呈现不同密度的自噬相关囊泡。对照OACs比HCs表现出显著更高程度的自噬相关囊泡免疫标记。aPRP在HCs和OACs中诱导相似的自噬相关囊泡形成，而PRGF处理的OACs比PRGF处理的HCs显示显著升高的自噬相关囊泡标记。PRGF还比aPRP诱导了更多的自噬相关囊泡形成。
3.3 aPRP和PRGF促进OACs中COL2A1和ACAN免疫标记
aPRP和PRGF处理后的OACs与对照相比表现出升高的COL2A1标记。两种处理均显著增加了OACs中COL2A1表达。对照OACs的COL2A1免疫标记率低于对照HCs。aPRP或PRGF处理的OACs与处理的HCs相比呈现相似的COL2A1水平。aPRP和PRGF均增加了OACs中ACAN免疫标记率，且OACs中ACAN诱导显著高于HCs。
3.4 aPRP促进OACs凋亡细胞比例，而PRGF降低该比例
aPRP处理的OACs（2.7%，2小时）中早晚期凋亡细胞比例从60%升至80%。aPRP增加了OACs中晚期凋亡细胞比例。未处理的OAC对照比HC对照表现出显著更高的早期凋亡、晚期凋亡、死亡/坏死细胞比例和更低的活细胞比例。1.8% PRGF处理的OACs在3小时后显示降低的早期凋亡细胞比例（30%）和诱导的晚期凋亡（10%）。aPRP显著降低了OACs的早期凋亡并增加了总体活细胞比例，而PRGF显著降低了OACs的细胞活力。
3.5 aPRP、PRGF和L-PRP升高HCs和OACs中TGF-β和PDGF-BB表达
2.7% aPRP处理的HCs和OACs在2和5小时呈现比对照更高的TGF-β浓度。aPRP在2小时显著增加了HCs和OACs的TGF-β水平，并在5小时维持OACs中升高的TGF-β水平。aPRP未显著改变HCs或OACs在2和5小时的PDGF-BB表达。1.8% PRGF或4.3% L-PRP在3和4小时升高了HCs和OACs中TGF-β或PDGF-BB浓度。PRGF处理的OACs比L-PRP处理的OACs产生更高TGF-β水平。L-PRP在3和4小时增加了HCs和OACs的PDGF-BB表达，且L-PRP处理的HCs比L-PRP处理的OACs显示显著更高的PDGF-BB水平。
四、讨论与结论
研究表明，aPRP和PRGF在低剂量和短时间内有效诱导OACs增殖，这一发现与传统依赖高剂量和长时间孵育的体外模型形成对比。从转化角度看，关节内注射的PRP在滑液中立即稀释并通过淋巴和滑液引流快速清除，关节滞留时间短。研究结果表明，有效的PRP制剂不需要过量给药即可发挥生物活性，早期爆发效应（低于5小时）在生理低剂量阈值下可能足以触发主要的细胞内信号通路，为无需高浓度或高容量注射即可实现有效关节内软骨修复的临床方案提供了临床前验证。
aPRP和PRGF在ED50值下显著增加了OACs细胞质中自噬相关囊泡标记至20%，并促进了COL2A1和ACAN表达，表明其刺激蛋白聚糖合成和软骨形成结构蛋白的能力。aPRP诱导OACs凋亡，可能代表一种由aPRP中特定生长因子驱动的选择性清除机制，而PRGF作为细胞保护剂，平衡HCs中早期凋亡和活细胞比例，中和基础培养应激而不诱导细胞毒性。aPRP在2小时内快速增加TGF-β水平并持续至5小时，解释了其对软骨细胞增殖的早期影响。PRGF提供了更平衡的TGF-β上调，与其细胞保护机制一致。
研究结论指出，2.7%浓度作用2小时的aPRP和1.8%浓度作用3小时的PRGF促进了OACs增殖。该体外数据表明aPRP支持OACs生长。PRGF降低了OACs中凋亡细胞数量。aPRP和PRGF均增加了OACs中COL2A1和ACAN蛋白水平。此外，aPRP、PRGF和L-PRP升高了HCs和OACs中TGF-β和PDGF-BB表达。临床上，尽管aPRP处理后软骨细胞出现凋亡囊泡，但OACs增殖的刺激令人鼓舞。总体而言，结合增加的TGF-β和PDGF-BB，该研究表明aPRP可能对骨关节炎关节产生有益效果。
