《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Concurrent activation of multiple programmed cell death pathways predicts 28-day mortality in pediatric sepsis: a retrospective PICU cohort study with differential sedative agent use between survivors and non-survivors
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摘要专业翻译
目的： 系统描述儿童重症监护病房（PICU）脓毒症患儿中与多种程序性细胞死亡（PCD）通路——包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡——相关的生物标志物表达谱，阐明其与器官功能障碍严重程度及临床预后的关联，并确定儿童28天全因死亡率的独立预测因子。
摘要专业翻译
目的： 系统描述儿童重症监护病房（PICU）脓毒症患儿中与多种程序性细胞死亡（PCD）通路——包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡——相关的生物标志物表达谱，阐明其与器官功能障碍严重程度及临床预后的关联，并确定儿童28天全因死亡率的独立预测因子。
方法： 研究开展了一项回顾性队列研究，纳入2021年1月至2023年12月期间荆州市第一人民医院PICU收治的208例儿童脓毒症患者（年龄1个月至18岁）。根据28天生存结局，将患者分为存活组（n = 148）和死亡组（n = 60）。在PICU入院24小时内检测以下血浆生物标志物：凋亡标志物（caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax）、焦亡标志物（NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）、坏死性凋亡标志物（RIPK1、RIPK3、MLKL）、铁死亡标志物（GPX4、铁蛋白、MDA、4-HNE）以及损伤相关分子模式（DAMPs：HMGB1、HSP70、S100A8/A9）。采用ROC分析、Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归进行预后评估。
结果： 28天死亡率为28.8%（60/208）。与存活者相比，非存活者的NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-18、RIPK3、MLKL、HMGB1、铁蛋白和MDA水平显著升高，而GPX4和Bcl-2/Bax比值显著降低（均P < 0.001）。NLRP3显示出最高的单项预测价值（AUC = 0.836），联合生物标志物组合（NLRP3+GPX4+HMGB1）显著优于单独的pSOFA评分（AUC = 0.896 vs. 0.786）。多变量Cox回归确定NLRP3 >2.45 ng/mL（HR = 2.847，95%CI：1.682–4.819）、GPX4 <12.3 ng/mL（HR = 2.234，95%CI：1.458–3.425）、HMGB1 >15.6 ng/mL（HR = 1.856，95%CI：1.142–3.015）以及pSOFA评分 >8（HR = 1.672，95%CI：1.089–2.567）为28天死亡率的独立预测因子（C-index = 0.821）。
结论： 儿童脓毒症中多种PCD通路被同时激活，其中NLRP3驱动的焦亡和GPX4缺乏相关的铁死亡是最强的独立死亡预测因子。从儿科麻醉学角度而言，具有明确抗焦亡或抗铁死亡特性的麻醉药物——包括右美托咪定和丙泊酚——可能作为辅助性器官保护策略。联合PCD生物标志物谱分析在传统严重程度评分之外提供了附加的预后价值，并识别出机制上不同的治疗靶点。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
脓毒症被定义为由感染引起的失调宿主免疫反应所导致的危及生命的器官功能障碍，是儿童健康领域的重大全球性紧急事件。与成人脓毒症相比，儿童脓毒症的流行病学、病理生理学和临床轨迹深受发育性免疫差异、年龄特异性合并症以及不同个体发育阶段免疫系统演变特征的影响。全球范围内，儿童脓毒症每年影响约2520万儿童，导致超过340万儿童死亡，约占所有PICU收治的25%–30%。尽管儿科重症监护取得了进展——包括规范化液体复苏、及时抗菌治疗和精细化通气策略——但高收入国家儿童脓毒性休克的死亡率仍为20%–40%，在资源有限的环境中则显著更高。
在儿科重症监护和围手术期医学领域，脓毒症占据着尤为特殊的位置。相当比例的PICU脓毒症患儿为术后病例——包括心脏手术、肿瘤切除、实体器官移植或复杂腹部手术后的恢复期患儿。在此围手术期背景下，麻醉诱导的免疫调节与已有或正在发展的脓毒症之间的相互作用，创造了一种不同于社区获得性儿童脓毒症的独特复杂病理生理环境。麻醉医师管理危重患儿时，不仅需要处理血流动力学复苏和器官支持，还需调控脓毒症相关器官功能障碍背后的炎症级联反应。
近年来，程序性细胞死亡（PCD）已成为脓毒症进展和结局的基本决定因素。与意外性坏死不同，PCD包含一系列由不同分子机制调控的基因编码细胞死亡模式，并伴随特定的炎症后果。在脓毒症中研究最为深入的PCD通路包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡。凋亡通过内源性（线粒体依赖）和外源性（死亡受体依赖）途径介导，导致免疫抑制性淋巴细胞和树突状细胞耗竭。焦亡是由gasdermin D（GSDMD）介导的促炎性溶解性细胞死亡，在NLRP3炎症小体激活下游执行，驱动IL-1β和IL-18释放，放大内皮通透性和细胞因子风暴。坏死性凋亡由RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴执行，促进细胞膜破坏和大量细胞内危险信号释放，与焦亡协同作用。铁死亡是由铁依赖性氧化性细胞死亡，以过量磷脂过氧化为特征，以GPX4失活为标志，越来越多地涉及脓毒症相关急性肾损伤、肝衰竭和心肌病。
将这些不同细胞死亡模式联系在一起的统一概念是损伤相关分子模式（DAMPs）的释放——从死亡细胞释放的内源性危险信号，与模式识别受体结合并维持无菌性炎症级联反应。HMGB1、热休克蛋白（HSP70）和S100警报素（S100A8/A9）是典型的DAMPs，激活TLR2、TLR4和RAGE信号，维持NF-κB驱动的促炎介质转录并放大器官损伤。关键的是，PCD通路并非孤立运作；凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡之间存在广泛的串扰，形成自我放大的正反馈环路，在儿科患者发育不成熟的免疫系统中可能尤为危险。
在儿科围手术期背景下，PCD调控的一个特别重要维度涉及麻醉药物对细胞死亡信号通路的潜在免疫调节作用。右美托咪定（DEX）是一种选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，广泛用于PICU镇静，在实验性脓毒症模型中已显示出强效的NLRP3炎症小体抑制和焦亡抑制特性。丙泊酚是儿科实践中最常用的静脉麻醉药，其2,6-二异丙基苯酚结构赋予其固有的抗氧化特性，并已被证明可减轻与铁死亡细胞死亡相关的脂质过氧化。这些麻醉药物与PCD信号通路之间的药理学相互作用提示，围手术期镇痛镇静药物的选择可能对脓毒症患儿具有器官保护意义。
然而，在理解人类儿童脓毒症中多通路PCD激活方面仍存在关键空白。大多数脓毒症PCD研究在成人人群中进行，向儿童的推演因先天免疫、炎症小体调控、氧化应激阈值和铁代谢方面有充分记录的发育差异而变得复杂。儿童脓毒症队列中全面的多通路PCD生物标志物谱分析仍然稀缺，联合PCD生物标志物组合在儿童中的临床预后效用尚未得到系统评估。因此，本研究旨在系统表征PICU儿童脓毒症患者的PCD通路生物标志物表达谱，阐明其与器官功能障碍严重程度和临床结局的关联，并确定28天全因死亡率的独立预测因子。
二、研究设计与主要技术方法
本研究为单中心回顾性队列研究，纳入2021年1月至2023年12月期间荆州市第一人民医院PICU收治的208例儿童脓毒症患者（年龄1个月至18岁），随访截止日期为2024年3月31日。根据2024年儿科脓毒症共识会议（PSCC）标准（Phoenix脓毒症评分≥2分且伴有疑似或确诊感染）进行诊断。排除标准包括新生儿或早产儿、活动性恶性肿瘤接受化疗或免疫治疗、器官移植或长期免疫抑制治疗、影响铁代谢或谷胱甘肽合成的遗传性疾病、入院时放弃治疗状态以及失访或不完整数据。最终208例患者纳入分析，其中存活组148例，死亡组60例。
主要技术方法包括：在PICU入院24小时内采集EDTA抗凝血样，离心后血浆于?80°C保存。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测凋亡标志物（caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax）、焦亡标志物（NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）、坏死性凋亡标志物（RIPK1、RIPK3、MLKL）、铁死亡标志物（GPX4、铁蛋白）、DAMP标志物（HMGB1、HSP70、S100A8/A9）；采用比色法检测脂质过氧化产物MDA和4-HNE。统计分析使用SPSS 26.0和R 4.2.1软件，包括ROC曲线分析（Youden指数确定最佳截断值）、Kaplan-Meier生存分析（Log-rank检验）、单因素及多因素Cox比例风险回归（C-index评估模型区分度）以及Bootstrap内部验证（1000次重采样）。
三、主要研究结果
3.1 一般特征
共纳入208例儿童脓毒症患者，男性118例（56.7%），女性90例（43.3%），中位年龄5.3岁（IQR：1.8–10.4）。28天总死亡率为28.8%（60/208）。最常见感染来源为肺部（53.4%）、腹部（24.5%）、泌尿道（13.5%）和其他/中枢神经系统（8.7%）。革兰阴性菌为主要病原体（62.5%）。值得注意的是，80例（38.5%）患者为术后PICU入院，反映了儿科外科人群中脓毒症的显著围手术期负担。
3.2 两组基线临床特征比较
存活组与死亡组在年龄、性别、体重及大多数合并症方面无显著差异（均P > 0.05）。但死亡组先天性心脏病（26.7% vs. 12.2%，P = 0.011）、慢性肾脏病（23.3% vs. 9.5%，P = 0.009）、脓毒性休克（63.3% vs. 23.0%，P < 0.001）、血管升压药使用（73.3% vs. 25.7%，P < 0.001）和机械通气需求（76.7% vs. 36.5%，P < 0.001）发生率显著更高。死亡组疾病严重程度评分显著更高，中位pSOFA评分为11（IQR：8–14），而存活组为6（IQR：4–9）（P < 0.001）；PRISM III评分分别为22（IQR：16–27）和12（IQR：8–17）（P < 0.001）。所有器官功能生物标志物（肌酐、总胆红素、ALT、肌钙蛋白I、CRP）在死亡组显著升高，而PaO?/FiO?比值显著降低（均P < 0.001）。临床上有意义的是，右美托咪定使用在存活组更常见（59.5% vs. 46.7%，P = 0.085），丙泊酚使用同样在存活者中呈升高趋势（43.2% vs. 30.0%，P = 0.075），但均未达到单因素组间比较的统计学显著性。
3.3 两组程序性细胞死亡生物标志物比较
所有PCD通路生物标志物在PICU入院时均显示存活组与死亡组之间的统计学显著差异。凋亡通路中，死亡组caspase-3和caspase-9水平显著升高，Bcl-2/Bax比值显著降低（均P < 0.001）。焦亡标志物NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18在死亡组均显著升高（均P < 0.001），其中NLRP3中位数升高2.5倍（3.12 vs. 1.24 ng/mL）。坏死性凋亡相关蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL在非存活者中同样升高。铁死亡标志物呈反向模式：GPX4显著降低（11.3 vs. 24.6 ng/mL），而铁蛋白、MDA和4-HNE在非存活者中显著升高，与增强的脂质过氧化和铁失调一致。DAMP标志物HMGB1、HSP70和S100A8/A9在死亡组均显著升高（均P < 0.001）。
3.4 ROC曲线分析与生存分析
对所有关键PCD生物标志物进行ROC曲线分析以确定其个体预后价值和28天死亡率预测的最佳截断值。焦亡标志物中，NLRP3显示出最高AUC（AUC = 0.836，灵敏度 = 79.4%，特异度 = 78.6%，最佳截断值 = 2.45 ng/mL）。铁死亡标志物中，GPX4显示出最高AUC（AUC = 0.819，灵敏度 = 77.9%，特异度 = 76.4%，最佳截断值 = 12.3 ng/mL）。HMGB1在DAMP标志物中AUC为0.801（灵敏度 = 76.5%，特异度 = 74.3%，最佳截断值 = 15.6 ng/mL）。联合生物标志物组合（NLRP3+GPX4+HMGB1）显著提高了预测性能（AUC = 0.896，95%CI：0.854–0.938），显著优于单独的pSOFA评分（AUC = 0.786，95%CI：0.725–0.847）。
Kaplan-Meier生存分析显示，NLRP3 >2.45 ng/mL的患者28天死亡率显著更高（52.4% vs. 19.4%，Log-rank χ2 = 24.567，P < 0.001），中位生存时间更短（18天[IQR：12–28] vs. 未达到）。同样，GPX4 <12.3 ng/mL的患者死亡率显著更高（56.1% vs. 17.5%，Log-rank χ2 = 26.234，P < 0.001）。HMGB1升高和pSOFA评分 >8也与显著更差的生存相关（均P < 0.001）。
3.5 单因素Cox回归分析
对所有候选变量进行单因素Cox回归分析。一般特征中，脓毒性休克（P = 0.001）、血管升压药使用（P = 0.002）、先天性心脏病（P = 0.060）和慢性肾脏病（P = 0.088）满足P < 0.10标准。所有临床严重程度参数包括pSOFA评分、PRISM III评分、乳酸和PCT均为显著预测因子（均P < 0.001）。所有PCD通路生物标志物在单因素分析中均与28天死亡率显著相关（均P < 0.001）。年龄、性别、术后状态、恶性肿瘤和抗生素方案不是显著预测因子（均P > 0.10）。共24个变量满足P < 0.10阈值，纳入多因素分析。
3.6 多因素Cox回归分析
在24个候选变量中，进行共线性诊断。焦亡组内，NLRP3与caspase-1（r = 0.82，VIF = 6.14）和IL-18（r = 0.76，VIF = 4.38）共线性最强。铁死亡组内，GPX4与MDA（r = ?0.79，VIF = 4.87）和铁蛋白（r = ?0.72，VIF = 4.23）呈强负相关。PRISM III与pSOFA评分呈中度共线性（r = 0.71，VIF = 4.12）。基于这些结果和临床意义，选择代表性变量：NLRP3代表焦亡（最高AUC）、GPX4代表铁死亡、HMGB1代表DAMPs、pSOFA评分代表临床严重程度。
向后逐步多因素Cox回归模型保留了四个独立预测因子，具有出色的区分能力（C-index = 0.821，95%CI：0.768–0.874；χ2 = 78.456，P < 0.001）：NLRP3 >2.45 ng/mL（HR = 2.847，95%CI：1.682–4.819，P < 0.001）、GPX4 <12.3 ng/mL（HR = 2.234，95%CI：1.458–3.425，P < 0.001）、HMGB1 >15.6 ng/mL（HR = 1.856，95%CI：1.142–3.015，P = 0.013）和pSOFA评分 >8（HR = 1.672，95%CI：1.089–2.567，P = 0.019）。Bootstrap内部验证（1000次迭代）产生乐观校正C-index为0.794（95%CI：0.741–0.847），相对表观估计的乐观度为0.027。Bootstrap校正的联合生物标志物组合AUC为0.871（95%CI：0.826–0.916）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次在特征明确的儿科PICU脓毒症队列中进行了全面的多通路PCD生物标志物谱分析。NLRP3驱动的焦亡被确定为儿童脓毒症死亡率的中心驱动因素，这与焦亡在脓毒症病理学中核心作用的日益增长的机制和临床证据一致。NLRP3炎症小体在巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞中的激活导致caspase-1介导的GSDMD切割，产生成孔性N末端GSDMD片段，引起渗透性细胞裂解，释放强效促炎细胞因子IL-1β和IL-18进入循环。儿童发育中的免疫系统与成人相比表现出独特的炎症小体调控特征：新生儿和幼儿倾向于显示高炎症性Th2偏向反应模式，IL-18敏感性增强，这可能解释了焦亡激活在儿科人群中可能尤为关键的原因。
GPX4耗竭相关的铁死亡在儿科器官功能障碍中具有重要病理生理意义。GPX4是铁死亡的主调控因子，负责还原毒性磷脂氢过氧化物并阻止最终驱动膜破裂的氧化级联反应。在氧化应激和铁过载条件下——两者在脓毒症中均常见——GPX4活性严重受损，释放不受控制的脂质过氧化，影响肾小管上皮、肝细胞和心肌细胞等高代谢活性细胞。儿童代谢率更高，氧化应激易感性比例上大于成人，可能使儿科组织在脓毒症期间特别容易受到铁死亡损伤。
HMGB1作为DAMPs的代表，在维持脓毒症晚期炎症中发挥核心作用。HMGB1最初从活化巨噬细胞释放，随后从坏死和焦亡细胞被动释放，即使在病原体清除后仍维持炎症。作为脓毒症致死性的晚期介质，HMGB1结合TLR2、TLR4和RAGE，激活下游NF-κB信号并促进额外促炎介质的转录。研究还指出，排除术后入院后的敏感性分析显示HMGB1关联减弱且不再具有统计学显著性（HR = 1.432，P = 0.124），与手术DAMP负荷部分夸大该亚组入院HMGB1信号一致。
关于PCD通路间的串扰，研究发现所有非存活者中凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡标志物同时升高，而存活者中激活更具选择性，提示多种PCD模式的同时参与——而非任何单一通路的激活——可能是致命结局的关键决定因素。代谢重编程与细胞死亡通路激活之间存在双向关系：线粒体功能障碍减少GPX4活性所需的NADPH供应，建立能量代谢受损与铁死亡易感性之间的直接机制联系；NLRP3炎症小体激活与线粒体活性氧（mtROS）生成和氧化磷酸化受损紧密耦合。
从儿科麻醉学角度，右美托咪定通过α2-肾上腺素能受体/PI3K/Akt信号轴磷酸化并使NLRP3蛋白复合物失活，减少caspase-1自身蛋白水解切割，减弱GSDMD孔形成，从而减轻IL-1β和IL-18释放。丙泊酚的2,6-二异丙基苯酚结构类似α-生育酚（维生素E），可淬灭自由基并抑制脂质过氧化，可能减轻磷脂氢过氧化物积累并部分补偿GPX4缺乏。研究强调，这些关于麻醉药物效应影响结局的观察仅为假设生成的二次分析，不应解释为临床疗效的证据。
研究结论指出，儿童脓毒症中凋亡、焦亡、坏死性凋亡和铁死亡等多种程序性细胞死亡通路被同时激活，通路同时参与的程度与器官功能障碍严重程度和28天全因死亡率密切相关。焦亡（以NLRP3升高为反映）和铁死亡（以GPX4降低为反映）是最强的不良预后独立预测因子，而HMGB1反映了DAMP驱动的无菌性炎症持续化。联合PCD生物标志物组合在pSOFA评分之外提供了显著的附加预后价值，并识别出机制上不同的治疗靶点。从儿科麻醉学角度，这些发现为研究右美托咪定和丙泊酚作为针对特定PCD通路的辅助性麻醉器官保护策略提供了令人信服的机制依据。
