肺微生物失调与TNF抑制与非结核分枝杆菌肺病恶化相关

《Frontiers in Microbiology》：Lung microbial dysregulation and TNF inhibition are associated with worsened nontuberculous mycobacterial lung disease

　　

摘要

引言：非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）是普遍存在的细菌，可引起多种疾病，尤其是肺病（nontuberculous mycobacterial pulmonary disease, NTMPD）。导致老年人NTMPD易感性和严重程度增加的宿主因素尚不清楚。先前研究报告，接受免疫调节生物制剂（如抗TNF和JAK-STAT抑制剂）的个体中NTMPD发病率增加。此外，研究人员近期描述了肺微生物组随年龄相关的变化，特别是主要共生菌Tropheryma物种的丢失，可能导致疾病严重程度增加。因此，在本研究中，研究人员探讨了TNF抑制和肺微生物组破坏是与不良NTMPD结局相关的关键因素这一假说。

方法：年轻（4–7岁）恒河猴被预先处理：（1）雾化阿米卡星和万古霉素以破坏肺微生物组；（2）TNF抑制剂Inflectra以抑制Th1反应；或（3）不予处理。随后动物在右肺接种禽分枝杆菌hominissuis亚种（M. avium subsp. hominissuis, MAH）。纵向监测细菌载量、影像学变化、免疫反应和微生物组组成。

结果与讨论：抗生素治疗的动物经历了显著的微生物组组成变化，包括肺微生物组中Tropheryma的耗竭。一只抗生素治疗的动物在肺微生物组恢复稳态后发生并消退空洞性疾病。一只Inflectra治疗的动物发展为慢性肉芽肿性疾病。没有对照动物出现肉芽肿。这些数据表明，肺微生物组破坏和TNF抑制与NTM肉芽肿性疾病易感性增加相关。

论文解读

**研究背景与目的**

非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）是环境中普遍存在的细菌，可通过气溶胶感染人肺，引起非结核分枝杆菌肺病（NTMPD）。免疫受损个体或存在基础肺病者风险更高，而年龄是重要危险因素，大多数致死性NTM病例发生于65岁以上人群。衰老伴随免疫衰老（immunosenescence）和肺微生物组失调，但具体机制因啮齿动物模型和临床研究的局限性而难以阐明。研究人员此前建立的恒河猴模型可模拟人类NTMPD的影像学和免疫学特征，并发现老龄动物感染禽分枝杆菌hominissuis亚种（M. avium subsp. hominissuis, MAH）后病情更重，其肺微生物组中共生菌Tropheryma丰度降低，且与影像学严重程度负相关。基于这些观察，研究人员假设TNF抑制和肺微生物组破坏是导致NTM肺病预后不良的关键因素，并设计本研究加以验证。

**研究设计与结论**

研究人员将12只年轻（4–7岁）恒河猴随机分为三组：对照组、抗生素组（雾化阿米卡星和万古霉素以破坏肺微生物组）和Inflectra组（TNF抑制剂以抑制Th1反应），随后在右肺接种MAH，纵向监测细菌载量、CT影像、免疫反应和微生物组。结果显示，与对照组相比，抗生素组和Inflectra组各有一只动物分别出现空洞性病变和肉芽肿性疾病，而对照组无肉芽肿，提示肺微生物组和TNF信号对控制NTM感染起保护作用。该研究进一步支持了Th1免疫应答和肺微生态完整性与NTMPD易感性相关的假说。

**主要技术方法**

研究使用12只来自俄勒冈国家灵长类研究中心（Oregon National Primate Research Center）的恒河猴。关键方法包括：胸部CT扫描与放射学评分；定量PCR（qPCR）和固体培养测定细菌载量；Luminex和ELISA检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的免疫介质和抗体；流式细胞术分析免疫细胞亚群及MAH特异性T细胞反应；16S rRNA基因扩增子测序（V4区）分析微生物组组成，并结合PICRUSt预测功能；对肺组织进行基于质谱的蛋白质组学分析。

**研究结果**

**抗生素治疗和TNF阻断与MAH感染后肉芽肿发生率增加相关**
通过qPCR和培养测定细菌载量，发现所有组在感染后7天（DPI）细菌载量达峰，随后快速清除；抗生素组和Inflectra组右肺的峰值细菌载量高于对照组。CT影像显示，对照组在83 DPI后基本恢复正常；抗生素组动物A3在40 DPI出现空洞，后逐渐缩小；Inflectra组动物I1出现持续性炎症，组织学证实为肉芽肿性疾病。对照组无此类病变。

**抗生素和Inflectra治疗与感染后肺内不同的炎症特征相关**
Luminex检测BALF免疫介质显示，对照组在28 DPI时具有较高水平的生长因子G-CSF、FGF basic以及IL-21、IL-17、IL-12、IFNβ和PD-L1；Inflectra组在114 DPI时TNF、IL-8、IL-6、IL-1β和Granzyme B水平升高，提示以急性期反应为主；抗生素组在15 DPI时IFNγ、CXCL11、CD40L等升高，表现为较强的Th1型反应。这表明不同干预导致不同的肺部炎症微环境。

**抗生素或Inflectra治疗与感染后肺内不同的免疫细胞组成相关**
流式细胞术显示，抗生素组和Inflectra组在7 DPI即出现CD4⁺和CD8⁺ T细胞流入，早于对照组（28 DPI）。MAH特异性IFNγ⁺TNF⁺ CD4 T细胞在各组均仅在86–184 DPI零星出现；MAH特异性CD8 T细胞在Inflectra组和对照组可检出，但抗生素组未检出。血浆中MAH特异性IgG在对照组略高，BALF中差异不显著。

**抗生素和Inflectra治疗以及感染引起肺微生物组组成变化**
16S rRNA测序显示，对照组和Inflectra组肺微生物组以Tropheryma为主，感染后短暂下降；抗生素组在0 DPI即因抗生素暴露而Tropheryma显著减少，感染后进一步降低且恢复缓慢。抗生素组中发生空洞的动物A3基线Tropheryma相对丰度最低（0.39%）。感染后所有组均出现口腔/上呼吸道共生菌的短暂增殖，但抗生素组持续时间更长、幅度更大。PICRUSt预测显示，Inflectra组在感染早期多个代谢和生物合成通路下调。

**来自抗生素和Inflectra治疗动物的病变邻近组织蛋白质组显示炎症变化**
对肺组织进行蛋白质组学比较，发现对照组C2的肺组织富集免疫球蛋白相关蛋白（IGLV3-9、IGHM、JCHAIN等），而Inflectra组I1病变邻近组织富集抗原呈递相关蛋白（HLA-E、HLA-DRA、HLA-DRB4）和缺氧/应激蛋白（HYOU1、SOD3）；抗生素组A3病变邻近组织富集组织重塑和自噬相关蛋白（KRT18、TGFBI、PRKAA1等），而对照组富集抗原受体信号和体液免疫蛋白。提示病变组织中缺乏有效的适应性体液免疫，而固有免疫和修复过程占主导。

**讨论与结论**

讨论指出，对照组早期高水平的IL-12、IL-17和修复性生长因子有助于控制感染，而Inflectra组和抗生素组分别表现出不同的异常免疫特征。抗生素组尽管出现较强Th1细胞因子应答，但Tropheryma缺失仍导致病变，说明肺微生物组稳态的重要性。蛋白质组学结果进一步支持病变组织内免疫失衡。研究局限性包括每组样本量小（仅4只）、病理事件局限于单只动物、未直接量化TNF中和程度，以及仅基于16S rRNA测序推断微生物功能；同时，单一干预未能完全模拟老年动物的易感表型，提示需要联合模型。结论认为，肺微生物组破坏和TNF抑制均与NTM肉芽肿性疾病易感性增加相关，NTMPD的年龄相关易感性是多因素共同作用的结果。