基于转录组学的杜氏肌营养不良症肌肉微环境中炎症失衡介导的肌肉损伤机制分析

《Frontiers in Neurology》：Transcriptomics-based analysis of muscle injury mechanism mediated by inflammatory imbalance in the Duchenne muscular dystrophy muscle microenvironment

　　

摘要专业翻译 背景： 杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种以进行性肌纤维损伤、慢性炎症反应和持续性纤维化重塑为特征的遗传性神经肌肉疾病，目前尚无统一的临床治疗方案。炎症-纤维化微环境被认为是DMD进展的关键驱动因素；然而，调控细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑和免疫失衡的关键分子仍未完全阐明。 方法： 研究人员整合了两个转录组数据集，构建了包含DMD患者和健康对照者的表达矩阵。基于三个代表性ECM基因集计算ECM活化评分。结合差异分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定与DMD及ECM活化相关的核心模块。针对交集基因构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并通过整合五种网络拓扑算法筛选核心基因（hub genes）。在蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型（protein tyrosine phosphatase receptor type C, PTPRC）高、低表达组中分析免疫细胞浸润特征，随后进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）。建立PTPRC敲低细胞模型，并应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blotting, WB）和免疫荧光（immunofluorescence, IF）验证PTPRC对C2C12成肌细胞分化的影响。 结果： DMD组的ECM活化评分升高，并显示出良好的诊断效能。按ECM评分分层后，ECM-High组表现出纤维化/上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）和免疫/炎症通路的激活，同时伴有代谢功能障碍和肌生成相关程序的异常激活。WGCNA进一步鉴定了与DMD状态和ECM评分均呈正相关的MEturquoise模块。将该模块与DMD和ECM差异基因取交集，获得PTPRC。免疫浸润分析显示，PTPRC_High组中M2巨噬细胞和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）比例增加。GSEA证实了12条炎症通路的显著激活。体外实验表明，PTPRC敲低显著促进成肌分化并减轻成肌细胞的纤维化表型。 结论： PTPRC可作为DMD的候选生物标志物。其高表达参与DMD相关的纤维化，可能与其介导的免疫抑制微环境有关。

论文解读

一、研究背景与立题依据

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种严重的X连锁隐性遗传性神经肌肉疾病，全球男性活产儿发病率约为1/3300，以进行性肌无力和运动功能丧失为主要临床表现。大多数DMD病例由编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的基因突变引起，该蛋白作为连接细胞内肌动蛋白细胞骨架与肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物的桥梁蛋白，对维持肌纤维肌膜完整性至关重要。这些突变导致dystrophin表达减少或缺失，进而引发肌纤维损伤。DMD的病理进展还伴随持续性炎症和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积，二者加速肌肉损伤和纤维化，同时损害肌肉再生能力。尽管泼尼松龙和地夫可特等皮质类固醇用于姑息治疗，但其长期疗效和安全性仍不明确，根治性疗法仍然缺乏。因此，亟需开发新的生物标志物和治疗靶点以改善DMD的诊断和管理。

慢性或失调的炎症可导致慢性炎症状态及随后的组织纤维化。在DMD中，持续的肌肉损伤引发以炎症细胞浸润增加、促炎因子升高和肌肉纤维化加速为特征的炎症反应。免疫细胞在此过程中发挥不可或缺的作用：M1巨噬细胞在疾病早期主导炎症反应，而M2巨噬细胞随疾病进展逐渐积累，通过分泌TGF-β等介质促进成纤维细胞增殖和胶原沉积。尽管这些观察将免疫细胞与DMD的炎症微环境联系起来，但调控炎症的关键分子仍未完全明确。转录组学已成为识别多种疾病关键基因的重要工具，为系统表征DMD肌肉微环境中的病理重塑提供了有力的技术支持。基于此，本研究旨在阐明ECM活化、炎症通路信号与肌生成之间的关联，筛选与DMD相关的核心基因，并通过免疫浸润分析揭示亚组间的免疫细胞组成差异，进一步通过细胞实验探索核心基因对成肌细胞分化和纤维化的影响。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员整合了两个公共基因表达数据集：GSE38417（微阵列平台，22个样本）和GSE109178（RNA-seq平台，49个样本），涵盖DMD患者和健康对照者，并使用ComBat算法进行批次效应校正。此外，额外下载了GSE6011（微阵列平台，36个样本）作为外部验证集。从MSigDB数据库获取三个代表性ECM相关通路基因集（KEGG_ECM_RECEPTOR_INTERACTION、KEGG_FOCAL_ADHESION和REACTOME_COLLAGEN_FORMATION），合并去重后构建综合ECM特征基因集。采用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）计算各样本的ECM活化评分，并通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评估其诊断效能。差异表达分析使用limma包进行。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）基于MSigDB Hallmark基因集进行。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）用于鉴定与DMD状态和ECM评分相关的核心模块。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并整合五种网络拓扑算法（Degree、Betweenness、Closeness、MCC、DMNC）筛选核心枢纽基因。免疫浸润分析采用CIBERSORT算法（LM22签名矩阵，22种免疫细胞类型）。单细胞转录组数据来源于公共数据集GSE288958（含5例健康对照和3例DMD患者的骨骼肌单核RNA-seq数据），使用Seurat包进行分析。细胞实验采用小鼠C2C12成肌细胞，通过siRNA敲低PTPRC，结合TGF-β1处理建立体外DMD炎症纤维化模型，运用qRT-PCR、Western blotting和免疫荧光进行功能验证。

三、主要研究结果

3.1 跨平台数据整合与ComBat算法批次校正

研究人员整合了GSE38417和GSE109178数据集。校正前，两个数据集的样本在PCA空间中完全按批次分离，而按生物学分组时DMD与对照样本区分度差。经ComBat校正后，两个数据集的样本在PCA空间中良好混合，同时DMD与对照样本按生物学分组清晰分离，证实ComBat有效消除了批次效应且未过度校正。

3.2 DMD病理微环境中炎症/纤维化通路的异常激活

ssGSEA分析显示，DMD患者（n=59）的ECM活化评分显著高于健康对照者（n=12）（p<0.001）。ROC曲线分析表明，综合ECM评分对DMD诊断的AUC达0.956（95% CI: 0.908–1.000）。在外部验证队列GSE6011中，DMD患者的ECM活化评分同样显著升高（p=6.13×10??），AUC为0.903。按ECM评分中位数将样本分为ECM-High和ECM-Low组后，GSEA显示ECM-High组中纤维化/EMT相关通路显著激活，包括EMT（NES=3.30）、血管生成（NES=2.28）、凝血（NES=2.18）和TGF-β信号通路（NES=1.86）；免疫/炎症通路也显著上调，包括干扰素-γ应答（NES=2.96）、干扰素-α应答（NES=2.85）、同种异体移植排斥（NES=2.51）、补体（NES=2.50）和TNF-α/NF-κB信号通路（NES=2.20）。相反，ECM-High组表现出代谢重编程特征，氧化磷酸化（NES=?2.88）、Myc靶点V2（NES=?2.02）和脂肪酸代谢（NES=?1.38）显著负富集。值得注意的是，肌生成基因集在ECM-High组中正富集（NES=1.53）。DMD与对照之间的差异表达分析（adj.P.Val≤0.05, |logFC|≥0.5）共鉴定出6,087个差异表达基因（DEGs），其中3,030个上调（如COL3A1、MYL5、HOXB3、RIPK2），3,057个下调（如MYH14、PNPLA6）。

3.3 DMD进展中核心共表达模块和候选基因的鉴定

WGCNA分析（软阈值β=4，无标度拓扑拟合R2>0.85）通过动态树切割鉴定了五个基因共表达模块。模块-性状相关分析显示，MEturquoise模块与DMD状态（r=0.78, p=7e-16）和ECM评分（r=0.93, p=2e-31）均呈强正相关。将DMD差异基因、ECM亚组差异基因和MEturquoise模块基因取交集，获得746个候选核心基因。

3.4 多算法筛选鉴定核心枢纽基因PTPRC

利用五种网络拓扑算法对746个候选基因进行评分，PTPRC是唯一在四种算法（Degree、MCC、Betweenness、Closeness）中均排名前10的基因，并在验证队列中表现出显著差异表达。STRING构建的PPI网络显示，PTPRC与30个相互作用蛋白形成高度互联的网络，包括CD4、ITGAM、CSF1R、ITGB2、CCL2、CD8A、COL3A1和COL1A2等多种免疫调控因子。单细胞转录组分析鉴定了八种主要细胞群：肌纤维、卫星细胞、成纤维细胞/成纤维-脂肪祖细胞（FAPs）、免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和肥大细胞。PTPRC在DMD中表达显著高于正常对照，且主要表达于免疫细胞和肥大细胞，在成纤维细胞/FAPs、脂肪细胞、内皮细胞等细胞群中呈低至中度表达，表明DMD组织中PTPRC升高主要反映免疫细胞浸润。

3.5 PTPRC高、低表达组的通路富集分析

KEGG分析显示，PTPRC-High组上调基因富集于多种免疫/炎症通路：吞噬体、补体和凝血级联、细胞黏附分子（CAM）相互作用、整合素信号通路和趋化因子信号通路。MSigDB Hallmark基因集的GSEA进一步证实了12条关键炎症相关通路的显著激活（FDR<0.05），其中干扰素γ应答和EMT富集程度最高，细胞黏附分子、炎症应答和TNF-α/NF-κB信号通路也强烈激活，共同形成由PTPRC驱动的炎症-纤维化信号网络。JAK-STAT、TGF-β和趋化因子信号通路的激活进一步提示高PTPRC表达状态与增强的炎症和纤维化相关信号网络相关。

3.6 PTPRC高、低表达组的免疫浸润分析

CIBERSORT分析显示，PTPRC-High组中M2巨噬细胞比例显著增加（adj.p=6.4e-07），是PTPRC-High组中增加最显著的细胞类型，表明高PTPRC表达状态与M2型巨噬细胞浸润增加及免疫抑制微环境特征相关。

3.7 PTPRC敲低促进C2C12成肌细胞分化并抑制纤维化

Western blotting显示，随着C2C12成肌分化时间的延长，肌生成标志物Myh6和MyoG逐渐上调，而PTPRC表达逐渐下降。TGF-β1处理显著抑制Myh6和MyoG表达并上调PTPRC。si-PTPRC转染后，qRT-PCR证实PTPRC mRNA表达显著降低。Western blotting显示，si-PTPRC显著逆转了TGF-β1介导的肌生成标志物（Myh6、MyoG）下调，并抑制纤维化相关蛋白（COL1A1、MMP9、CTGF）的上调。免疫荧光进一步证明si-PTPRC组的肌管融合指数显著高于si-NC组。

3.8 PTPRC参与TGF-β/SMAD信号应答的机制研究

Western blotting结果显示，si-NC组经TGF-β1刺激后p-SMAD2（Ser465/467）蛋白信号增强，表明该刺激条件有效激活了经典TGF-β/SMAD信号通路，而总SMAD2蛋白丰度在各组间无明显变化。与si-NC+TGF-β1组相比，si-PTPRC+TGF-β1组的p-SMAD2（Ser465/467）信号减弱，而总SMAD2水平相对稳定，提示PTPRC敲低可能削弱TGF-β1触发的SMAD2活化。

四、讨论与结论

本研究表明，DMD患者肌肉组织中ECM相关通路显著激活，伴随代谢相关通路抑制和肌生成程序激活，提示DMD肌肉中存在纤维化、代谢异常和代偿性再生反应共存的复杂病理状态。PTPRC（又称CD45）是一种广泛表达于造血细胞的酪氨酸磷酸酶受体，参与T细胞、B细胞和巨噬细胞的活化与信号转导。PTPRC失调与多种免疫相关疾病密切相关，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和皮肌炎。在炎症性关节炎小鼠模型中，PTPRC缺陷减弱了中性粒细胞向炎症部位的迁移；在肺部炎症和纤维化模型中，PTPRC负调控ILC2活化以抑制气道炎症和肺纤维化。本研究的多维度生物信息学筛选确立了PTPRC作为DMD核心枢纽基因的地位，其在DMD患者肌肉中异常高表达，提示PTPRC通过调节局部炎症状态参与DMD发病。单细胞转录组分析进一步验证了PTPRC的免疫偏向性表达，与CD45作为白细胞共同抗原的经典身份一致。免疫浸润分析显示PTPRC-High组中M2巨噬细胞显著升高，提示高PTPRC表达状态与M2型巨噬细胞浸润增加和免疫抑制微环境特征相关。体外实验表明，TGF-β1上调PTPRC并抑制肌生成分化标志物，而PTPRC敲低部分逆转TGF-β1诱导的纤维化，将PTPRC置于炎症-纤维化调控轴的核心位置。

本研究存在以下局限性：功能验证仅在C2C12成肌细胞中进行，缺乏动物模型或患者样本的确认；DMD中免疫细胞的影响仅通过生物信息学推断，缺乏实验支持。未来研究应整合临床样本和动物模型，进一步阐明DMD微环境中炎症-纤维化网络的动态调控机制。

研究结论： PTPRC可作为DMD的候选生物标志物。其高表达参与DMD相关的纤维化，可能与其介导的免疫抑制微环境有关。PTPRC敲低可有效拮抗TGF-β1诱导的肌生成抑制和纤维化表型，提示PTPRC是DMD肌肉微环境中的潜在关键调控因子。