靶向HMGB2联合MDM2抑制剂在弥漫内生性脑桥胶质瘤治疗中的协同抗肿瘤效应

《Frontiers in Oncology》：Synergistic antitumor effect of HMGB2 targeting combined with MDM2 inhibitor in diffuse intrinsic pontine glioma therapy

　　

摘要专业翻译 弥漫内生性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）是一种预后极差的儿童脑恶性肿瘤。高迁移率族蛋白B2（high mobility group box 2，HMGB2）是HMGB家族染色质相关蛋白成员之一，已被鉴定为多种癌症中的潜在致癌基因。然而，HMGB2在DIPG中的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员观察到HMGB2在多种癌症类型中异常表达，其表达水平与泛癌临床结局呈负相关。研究人员在DIPG细胞中检测到HMGB2高表达，而在原代脑干神经祖细胞（primary brainstem neural progenitor cells，PPCs）中未检测到高表达。敲低HMGB2显著抑制DIPG细胞增殖并诱导细胞凋亡。有趣的是，批量RNA测序（bulk RNA sequencing）显示，抑制HMGB2可上调p53蛋白表达并增强p53-p21轴的活性。将HMGB2抑制剂与p53-MDM2抑制剂RG7388联用，可通过激活肿瘤抑制因子p53和p21的表达，在体外（in vitro）协同抑制DIPG细胞生长并促进细胞凋亡。动物研究表明，联合治疗显著抑制了原位DIPG荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长了其生存期。这些发现表明，HMGB2在DIPG肿瘤发生中发挥致癌基因的作用，靶向HMGB2联合MDM2抑制剂为DIPG治疗策略的开发提供了新的临床前基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

弥漫内生性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）是弥漫中线胶质瘤（diffuse midline glioma，DMG）的一种亚型，约占所有脑干胶质瘤的80%，是儿童脑肿瘤相关死亡的首要原因。DIPG的年发病率约为每10万人1.78例，高发年龄为6至9岁，中位生存期不足一年，五年生存率低于5%。目前，放疗是NCCN指南推荐的标准治疗方案，但也仅能将生存期延长3至4个月，其他治疗策略均被证实无效。近年来，对DIPG生物学特征的认识取得了显著进展，这些肿瘤主要由H3.3和H3.1基因突变定义。在2021年WHO分类中，DMG被重新归类为伴有H3 K27变异的肿瘤。其他常见遗传变异，如肿瘤蛋白p53（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、蛋白磷酸酶1D（PPM1D）和激活素A受体1型（ACVR1）基因突变，已被确定为潜在的治疗靶点。然而，尽管进行了大量努力，DIPG的预后数十年来基本未得到改善，凸显了改进治疗结局的迫切需求。

高迁移率族蛋白盒（high mobility group box，HMGB）家族是真核细胞中第二大丰富的染色质蛋白家族，参与修复受损DNA并调控DNA复制、转录和重组。其中，HMGB2已被证实与多种癌症的肿瘤发生相关。HMGB2表达升高与乳腺癌和胃癌患者生存期缩短相关，并在细胞增殖和侵袭中发挥抗凋亡因子的作用。然而，HMGB2在DIPG中的作用仍知之甚少。因此，本研究旨在探究HMGB2在DIPG中的功能，并探索其作为治疗靶点的潜力，特别是与其他药物联合应用的可行性，为攻克这一毁灭性疾病提供新的临床前视角。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术方法开展研究。首先，利用GEPIA数据库和Kaplan-Meier Plotter软件分析了HMGB2在泛癌中的表达及其与临床结局的关联。其次，通过慢病毒介导的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）干扰技术构建HMGB2稳定敲低的DIPG细胞系。第三，采用批量RNA测序（bulk RNA sequencing）分析HMGB2抑制后的差异表达基因及富集通路。第四，通过细胞活力测定、流式细胞术（凋亡和细胞周期分析）和蛋白质印迹法（Western blotting）评估细胞增殖、凋亡、细胞周期及相关蛋白表达。第五，建立原位DIPG小鼠模型进行体内药效评价，通过生物发光成像监测肿瘤生长并记录生存期。细胞系方面，研究使用了3株患者来源的DIPG细胞系（TT150714、TT150630、TT170720），均经鉴定为TP53野生型，并以原代脑干神经祖细胞（PPCs）作为正常对照。动物实验使用4周龄雌性NCG小鼠，每组5只。

三、研究结果

3.1 DIPG细胞中HMGB2表达水平较高

研究人员首先利用GEPIA数据库分析了多种人类癌症及其配对正常样本中HMGB2的mRNA表达水平。在TCGA数据集的RNA-seq数据中，HMGB2在多种癌症类型中过表达，包括肾上腺皮质癌（ACC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、结肠腺癌（COAD）、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、胶质母细胞瘤（GBM）和胸腺瘤（THYM）。通过KM plotter数据库进行的生存分析显示，HMGB2表达升高与泛癌患者的不良预后显著相关。蛋白质印迹分析结果表明，DIPG细胞系TT150714、TT150630、TT170720、TT190313和TT190326的HMGB2表达水平显著高于原代脑干神经祖细胞系PPC-1和PPC-2。这些结果提示HMGB2可能在DIPG肿瘤发生中发挥致癌基因的作用。

3.2 敲低HMGB2增强DIPG细胞中p53的表达水平

研究人员利用慢病毒介导的shRNA干扰技术下调DIPG细胞系中HMGB2的表达，蛋白质印迹分析证实shHMGB2#1和shHMGB2#3可有效敲低HMGB2表达。随后，使用HMGB2抑制剂Inflachromene（ICM）处理DIPG细胞后进行批量RNA测序，KEGG通路分析显示HMGB2抑制后p53信号通路受到显著影响。在HMGB2敲低细胞中进一步检测p53表达，发现p53水平显著升高，与RNA测序数据一致。这些数据表明抑制HMGB2与DIPG细胞中肿瘤抑制蛋白p53的激活相关。

3.3 HMGB2抑制联合MDM2抑制剂协同抑制DIPG细胞生长

通过细胞活力测定验证了HMGB2对DIPG细胞生长的影响。敲低HMGB2显著抑制了TT150714、TT170720和TT150630细胞系的细胞生长。用p53-MDM2抑制剂RG7388处理HMGB2敲低细胞后发现，RG7388单独使用可显著抑制DIPG细胞生长，并增强了shHMGB2#1和shHMGB2#3诱导的HMGB2敲低的抑制效果。进一步将HMGB2抑制剂ICM与RG7388联合处理TT150714和TT150630细胞系，ICM的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为531 nM和468 nM。协同分析显示，联合治疗表现出显著的协同效应，代表性剂量组合的联合指数（combination index，CI）值均小于1，证实ICM与RG7388之间存在强协同相互作用。

3.4 抑制HMGB2增强DIPG细胞凋亡并诱导G0/G1期阻滞

研究人员评估了HMGB2抑制剂ICM和MDM2抑制剂RG7388联合处理的长期效应。单独使用ICM或RG7388处理48小时后均显著抑制DIPG细胞生长，但两种药物联用显示出最强的生长抑制效果。Annexin V/FITC-PI双染测定显示，ICM和RG7388处理后凋亡细胞比例增加，联合处理组的凋亡率在所有组中最高。流式细胞术分析进一步揭示，ICM或RG7388单独处理均可显著诱导DIPG细胞G0/G1期阻滞，而联合处理对G0/G1期阻滞表现出协同效应。ICM和RG7388联合处理DIPG细胞后，p53和p21的表达水平较单独处理组或对照组最高，与凋亡数据一致。

3.5 抑制HMGB2在体内抑制DIPG肿瘤生长

研究人员建立了原位DIPG小鼠模型，将荧光素酶转导的DIPG细胞植入NCG小鼠脑桥。肿瘤植入后第21天的生物发光成像显示，载体处理组的肿瘤生长速度快于任一药物处理组，而ICM和RG7388处理组之间无显著差异。联合处理组的肿瘤生长最慢，凸显了两种药物对DIPG肿瘤生长的协同抑制作用。此外，ICM和RG7388联合处理延长了DIPG小鼠模型的生存期，而单独使用RG7388未观察到统计学显著的生存获益。在实验终点收取肿瘤组织进行蛋白质印迹分析和免疫组织化学染色，结果与前述数据一致，包括HMGB2下调和p53及p21上调。

四、讨论与结论

本研究表明，HMGB2在DIPG细胞中过表达，抑制HMGB2可通过激活p53/p21信号通路抑制DIPG细胞增殖并诱导细胞凋亡，提示HMGB2可作为DIPG有价值的治疗靶点。HMGB2抑制剂ICM与MDM2抑制剂RG7388的联合治疗在体外和体内均表现出协同抗肿瘤效应。该研究首次报道抑制HMGB2与p53信号通路激活相关。然而，研究存在若干局限性：HMGB2沉默介导p53上调的分子机制尚未阐明；ICM是HMGB1和HMGB2的双靶点抑制剂，不能完全排除HMGB1在DIPG中的潜在功能；仅检测了p53总蛋白水平及其下游p21，未探索p53转录活性、翻译后修饰及其他靶基因；所有使用的DIPG细胞系均为TP53野生型，该联合策略可能不适用于TP53突变型DIPG亚型；ICM的血脑屏障穿透效率和药代动力学尚未定量检测；未对肿瘤组织进行HMGB2、p53和Ki67的免疫组织化学染色。总体而言，本研究证明抑制HMGB2可抑制DIPG细胞增殖并促进细胞凋亡，首次报道抑制HMGB2与p53信号通路激活相关，HMGB2与MDM2抑制剂联合治疗可能是一种值得进一步研究的DIPG治疗策略。