### 中文标题 镉、汞、锌、铜和铅对濒危锡斯坦雪鳟（*Schizothorax zarudnyi* Nikolskii, 1897）（鲤形目：鲤科）精子运动参数影响的比较研究

《Aquaculture Science and Management》：Comparative effects of cadmium, mercury, zinc, copper, and lead on sperm motility parameters of the endangered sistan snowtrout (Schizothorax zarudnyi Nikolskii, 1897) (cypriniformes: cyprinidae)

　　

**背景：** 精子运动能力是鱼类精液质量和繁殖成功的关键指标。本研究对五种潜在有毒金属——镉（Cd）、汞（Hg）、锌（Zn）、铜（Cu）和铅（Pb）——对地方性锡斯坦雪鳟（*Schizothorax zarudnyi*）精子运动参数的短期体外影响进行了比较评估。

**方法：** 研究人员将6尾雄性亲鱼的精子样本暴露于浓度为0（对照组）、0.1、1、10和100 mg/L的每种金属氯化物中。采用光学显微镜和视频分析记录了总运动持续时间以及80%、40%和10%运动水平下的精子运动百分比。

**结果：** 所有金属均以浓度依赖性方式显著降低了精子运动持续时间和百分比（p < 0.05）。在100 mg/L金属氯化物浓度下，Cd和Hg导致精子完全且立即失活，而Zn、Cu和Pb则显著降低但未完全消除精子运动能力。基于有效浓度的毒性顺序为：Hg ≈ Cd > Pb > Cu > Zn。精子敏感性随时间增加：即使在0.1 mg/L浓度下，所有金属均显著缩短了仅有10%或40%精子保持运动的时间，而在80%运动水平下的差异较小。

**结论：** 这些体外研究结果表明，在实验室条件下，环境相关浓度的重金属可严重损害*S. zarudnyi*的精子质量，可能降低受污染栖息地中的繁殖成功率。该研究结果为哈蒙国际湿地生态系统中这一地方性物种的保护管理提供了重要的基础数据。

### 论文解读文章

**一、研究背景与科学问题**

潜在有毒金属是一类持久性环境污染物，可通过农业径流、工业废水、采矿活动和城市污水在水生态系统中累积。与有机污染物不同，金属无法被生物降解，并可通过食物链进行生物放大，对水生生物和人类健康构成严重威胁。水体中的主要金属污染物包括镉（Cd）、汞（Hg）、铅（Pb）、铜（Cu）和锌（Zn）。近期全球评估表明，淡水生态系统中金属浓度经常超过建议的安全阈值，尤其是在农业和工业活动密集的地区。

位于伊朗东部的哈蒙湿地复合体是地方性锡斯坦雪鳟（*Schizothorax zarudnyi*）的栖息地，由于农业回流水和未经处理的城市污水，该区域已被确定为潜在的金属污染区域。监测研究已记录了哈蒙湿地和Chah Nimeh水库水体及沉积物中Cd、Pb、Cu和Zn的升高水平，表明这些金属对*S. zarudnyi*的自然栖息地构成了当前的环境关切。

繁殖损伤是鱼类金属毒性最敏感的终点指标之一。精子质量，尤其是运动能力，是决定鱼类受精成功的关键因素。鱼类精子在与水接触时被激活，其运动对离子组成的变化和有毒物质的存在高度敏感。此前的研究表明，金属可通过多种机制干扰精子功能，包括氧化应激、线粒体损伤和钙信号传导干扰。然而，本研究仅聚焦于运动参数的评估，而非探究这些潜在机制。体外精子运动分析为评估环境污染物的生殖毒性提供了一种快速、可靠且符合伦理的方法。

锡斯坦雪鳟是原产于伊朗东部锡斯坦地区和阿富汗西部的特有淡水鱼类，隶属于鲤科（Cyprinidae），栖息于具有国际重要性的拉姆萨尔湿地——哈蒙湿地复合体。该物种对当地社区具有生态和经济重要性，但由于栖息地退化、水资源短缺、干旱和污染，其种群数量已急剧下降。根据IUCN红色名录和国家评估，该物种被列为濒危物种。其繁殖季节为冬末至早春（2–3月），恰逢可能含高浓度重金属的农业径流期。

尽管*S. zarudnyi*具有生态和保护重要性，但关于重金属对其繁殖生理影响的数据十分匮乏。此前对该物种的研究仅考察了Cu和Pb的影响，尚未开展涵盖五种主要重金属（Cd、Hg、Zn、Cu和Pb）的比较研究。因此，本研究旨在：（1）研究Cd、Hg、Zn、Cu和Pb对*S. zarudnyi*精子运动持续时间和运动精子百分比的体外影响；（2）比较这五种金属的相对毒性；（3）评估精子在不同运动水平（80%、40%、10%）下随时间变化的敏感性；（4）为这一濒危物种的环境风险评估和保护管理提供初步数据。

**二、研究设计与方法**

研究人员在繁殖季节（2025年2–3月）使用抄网从Chah Nimeh水库（伊朗锡斯坦）采集了6尾性成熟的雄性锡斯坦雪鳟。所有动物实验均符合伦理准则并获得Zabol大学伦理委员会批准（批准号：UZ.1399.013），鱼类采集获得了伊朗环境部颁发的科研许可（许可证号：DOE-1401-083）。鱼类在Zehak本地鱼类繁殖和放流中心的水泥池中暂养两周，期间每日监测水质参数。

为同步和促进排精，研究人员对雄性亲鱼进行肌肉注射奥瓦普利姆（ovaprim，含鲑鱼促性腺激素释放激素类似物和多巴胺拮抗剂多潘立酮）。注射12小时后通过轻柔的腹腔按压收集精子，直接挤入无菌微量离心管并置于碎冰上。只有初始运动率>90%的样本被用于实验，每尾雄鱼的精子被视为一个独立的生物学重复（n = 6）。

五种金属氯化物（CdCl?、HgCl?、ZnCl?、CuCl?·2H?O和PbCl?）均购自Merck公司（德国达姆施塔特）。每种金属盐以蒸馏水新鲜配制浓度为0.01、0.1、1、10和100 mg/L的工作溶液，蒸馏水作为对照组（0 mg/L）。所有溶液的pH调节至7.8 ± 0.1，渗透压在5–15 mOsm/kg范围内，以确保观察到的效应可归因于金属离子而非理化参数差异。

精子运动分析按照标准化方案进行。将1 μL精子滴于血球计数板上，加入1 μL测试溶液（金属溶液或对照蒸馏水）激活精子，1:1稀释后的最终暴露浓度分别为0.1、1、10和100 mg/L。在配有40倍相差物镜的光学显微镜（总放大400倍）下，使用数码相机以30帧/秒记录60–120秒视频。两名对处理条件不知情的独立观察者分析视频记录，测量总运动持续时间（从激活到99%精子停止运动的时间）以及80%、40%和10%精子保持运动的时间点。观察者间信度通过组内相关系数（ICC）评估，所有参数均超过0.92。

数据以平均值±标准差（SD）表示，采用Kolmogorov–Smirnov检验正态性和Levene检验方差齐性。由于同一雄鱼的精子样本暴露于不同金属和浓度（重复测量），使用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA），以雄鱼个体作为随机因素，浓度作为固定效应。检测到显著效应时，采用Bonferroni校正的事后配对比较。所有统计分析使用SPSS 26.0完成，显著性水平设为α = 0.05。

**三、主要研究结果**

**总运动持续时间**：五种金属均以浓度依赖性方式显著降低精子总运动持续时间（单因素方差分析，p < 0.05）。对照组（蒸馏水）中精子平均运动63.12秒。镉（CdCl?）和汞（HgCl?）是毒性最强的金属：在100 mg/L盐浓度下（分别相当于61.3 mg/L Cd和73.9 mg/L Hg），两种金属导致精子完全且立即失活；在10 mg/L时，Cd将运动时间降至10.33 ± 0.01秒（较对照组减少83.6%），Hg降至16.58 ± 0.01秒（减少73.7%）。铅（PbCl?）呈中等毒性：100 mg/L时运动时间降至15.0 ± 0.02秒（减少76.2%），但未观察到完全失活；10 mg/L时降至28.0 ± 0.04秒（减少55.6%）。铜（CuCl?）在低浓度时毒性低于Pb，但在高浓度时效应相似：100 mg/L时运动时间降至25.0 ± 0.03秒（减少60.4%），10 mg/L时为35.0 ± 0.05秒（减少44.5%）。锌（ZnCl?）是毒性最低的金属：100 mg/L时运动时间降至29.53 ± 0.01秒（减少53.2%），但精子仍显示微弱的鞭毛摆动。基于10 mg/L盐浓度下运动减少百分比的毒性顺序为：Cd（83.6%）> Hg（73.7%）> Pb（53%）> Cu（42%）> Zn（32%）。

**不同运动水平的时间变化**：对照组中，80%精子保持运动的时间为22.32 ± 1.57秒，40%为39.66 ± 1.52秒，10%为59.00 ± 3.5秒。Cd暴露在所有浓度和所有运动水平均显著缩短持续时间（p < 0.05）：100 mg/L时所有水平立即丧失运动能力（0秒）；0.1 mg/L时80%运动时间减少25%（至16.67秒），但10%运动时间减少45%（至32.62秒）。Hg表现出与Cd相似的效应但在低浓度时效力略低：0.1 mg/L时10%运动时间降至36.33秒（减少38%）；100 mg/L时立即停止运动。Zn对精子寿命的损害最小：即使在100 mg/L时，仍有10%精子可运动24.89秒，80%运动持续5.07秒；0.1 mg/L时10%运动时间（52.20秒）仅较对照组低12%。Cu呈中等毒性：100 mg/L时10%运动时间降至约22秒（减少63%），0.1 mg/L时约50秒（减少15%）。Pb毒性高于Cu但低于Cd/Hg：100 mg/L时10%运动时间降至约14秒（减少76%），0.1 mg/L时约46秒（减少22%）。

**时间依赖性敏感性增加**：本研究的显著发现是精子对微量金属的敏感性随时间大幅增加。激活早期阶段（80%精子运动时，对照组约0–22秒），对照组与低浓度（0.1 mg/L）处理之间的差异通常不具有统计学显著性。然而在后期阶段（仅40%或10%精子保持运动时，即30–60秒后），即使是最低浓度的所有金属也导致与对照组相比的显著降低（p < 0.05）。Cd和Hg表现出最大的年龄依赖性敏感性增加。

**四、讨论与结论**

本研究对五种金属对*S. zarudnyi*精子运动参数的影响进行了比较评估。结果明确表明，所有测试金属均以浓度和时间依赖性方式显著损害精子运动能力，且金属间毒性差异显著。毒性顺序（Hg ≈ Cd > Pb > Cu > Zn）与文献中关于这些金属对鱼类精子相对效力的普遍共识一致。Hg和Cd的极端毒性可能归因于其对巯基的高亲和力、线粒体功能破坏、钙信号干扰和氧化应激诱导。Pb的中等毒性与其干扰钙依赖性过程一致，而Zn的较低毒性反映了其作为正常生殖功能所需必需微量元素的作用，仅在超生理浓度时才表现出毒性。然而，需要强调的是，本研究旨在评估运动参数，并未直接测量ATP水平、活性氧（ROS）产生、线粒体功能或膜完整性等机制终点。上述机制解释基于已有文献，应被视为潜在机制而非本研究的直接发现。

Hg2?对精子质膜、鞭毛微管和线粒体膜蛋白中的巯基（-SH）具有极高亲和力，可改变膜流动性和通透性，导致鞭毛运动所必需的离子梯度丧失。Hg还抑制线粒体呼吸关键酶（如琥珀酸脱氢酶和细胞色素c氧化酶），使ATP产生降低至持续运动所需阈值以下，并产生活性氧（ROS）引起精子质膜脂质过氧化和DNA氧化损伤。Cd2?可与Ca2?竞争通过精子质膜上的电压门控钙通道进入细胞，而Ca2?是鞭毛运动的关键调节因子，Cd的替代扰乱了精子激活和持续运动所需的正常Ca2?信号级联反应。

100 mg/L Hg和Cd导致完全失活与虹鳟、西伯利亚鲟和非洲鲶鱼的发现一致。然而，物种特异性敏感性差异存在：白鱼（*Rutilus frisii kutum*）需要1000 mg/L Cd才能完全失活，表明*S. zarudnyi*与其他鲤科鱼类相比属于中等敏感。

Pb的毒性主要涉及干扰钙依赖性过程。Pb2?可替代钙结合蛋白（包括钙调蛋白和蛋白激酶C）中的Ca2?，破坏调节鞭毛运动的信号通路。随精子老化Pb效应逐渐增强，提示Pb可能干扰内源能量储备耗竭时至关重要的ATP再生机制。鉴于哈蒙湿地有记录的Pb污染，繁殖季节亲鱼慢性暴露于Pb可能显著降低自然补充量。

Cu的毒性机制涉及膜损伤和氧化应激。Cu2?催化Fenton反应，从过氧化氢生成高反应活性的羟基自由基（•OH），导致脂质过氧化和DNA损伤。本研究仅在≥1 mg/L时观察到显著运动降低，与某些物种的研究一致，但与其他物种的高敏感性不同，这些差异可能反映了精子膜组成、精浆金属结合能力和抗氧化系统的物种特异性差异。

Zn是毒性最低的金属，与其作为超过300种酶（包括保护细胞免受氧化损伤的超氧化物歧化酶SOD）辅因子的必需微量元素角色一致。高浓度Zn通过与钙调蛋白等调节蛋白上的Ca2?结合位点竞争而产生毒性。在100 mg/L时Zn使运动减少53%但未完全停止，与鲤鱼精子在500 mg/L Zn时完全失活的报道形成对比。

精子对重金属敏感性随时间显著增加对理解受精动态具有重要意义。在关键受精窗口（激活后前10–30秒），低金属浓度可能对运动能力影响甚微，若卵子立即可用则受精可能正常进行。但在天然产卵环境中，若卵密度低或雄性竞争激烈，精子可能需要长时间保持运动。此时即使低金属浓度也可能显著降低成功受精的概率。这种年龄依赖性敏感性增加可能归因于细胞内ATP储备的逐渐耗竭，使老化精子更依赖于高效的离子调节和膜完整性——而这两者正是金属毒性的主要靶点。

本研究所用浓度（金属盐0.1–100 mg/L）涵盖了从环境相关水平（0.1 mg/L）到极端污染（100 mg/L）的范围。根据哈蒙湿地现有监测数据，旱季Cd和Pb浓度通常为<0.001至0.05 mg/L，Zn和Cu为0.01–0.1 mg/L；农业径流事件期间（2–3月，正值*S. zarudnyi*繁殖季节），Pb和Cu浓度可超过0.5 mg/L，Zn可超过1.0 mg/L。但应注意这些是文献值，本研究未在采样期间对研究区域进行直接野外金属浓度测量，因此实验室发现向野外条件的直接外推应谨慎。在0.1–1.0 mg/L浓度下，所有金属均显著缩短10%运动时间（减少15–45%），这可能降低成功受精的概率，尤其是在金属负荷较高的区域。

研究局限性包括：（1）体外暴露系统不能完全模拟精浆成分可能保护精子免受金属毒性的体内条件；（2）仅评估了精子运动能力，未来研究应纳入计算机辅助精子分析（CASA）、DNA碎片化分析和氧化应激生物标志物；（3）每种金属单独测试，而环境污染物通常以复杂混合物形式存在；（4）样本量（n = 6尾雄鱼）足以检测统计学显著差异但可能无法完全反映自然变异；（5）本研究未测量机制终点亦未进行野外验证。

**结论：** 本研究在体外条件下对五种金属——镉、汞、锌、铜和铅——对地方性锡斯坦雪鳟*S. zarudnyi*精子运动参数的影响进行了比较评估。关键发现表明，所有五种金属均以浓度依赖性方式显著降低精子运动能力，毒性顺序为Hg ≈ Cd > Pb > Cu > Zn。Hg和Cd毒性最强，在100 mg/L时导致完全失活，Zn毒性最低。重要的是，精子敏感性随时间增加，即使低浓度（0.1 mg/L）也显著缩短仅有10%或40%精子保持运动的时间。观察到显著效应的浓度（0.1–1.0 mg/L）与哈蒙湿地记录的金属浓度重叠，表明野生*S. zarudnyi*种群可能面临繁殖受损的风险。然而，必须强调这些发现基于实验室实验，并不能直接证明野外环境效应。研究结果应被解读为提示需进一步调查的潜在风险，而非种群水平影响的确定性证据。未来整合野外监测、体内暴露和受精成功评估的研究将有助于确证这些体外观察的生态相关性。