分离自垃圾填埋场覆盖土壤的新种Methylococcus magnus sp. nov.：一种新型耐盐耐热甲烷氧化菌

《Microbiology》：Methylococcus magnus sp. nov., a Novel Halo- and Thermotolerant Methanotroph from a Landfill Cover Soil

　　

甲基球菌属（Methylococcus）以严格好氧的革兰氏阴性球菌和双球菌为代表，它们利用甲烷作为碳源和能源。这些细菌栖息于甲烷可利用性高的多种生境。目前该属绝大多数已表征的成员是嗜热微生物，对NaCl高度敏感。本文报道了首株耐盐的甲基球菌属代表——菌株Мс7Т的分离与鉴定，该菌株分离自垃圾填埋场覆盖土壤。该菌株细胞（大小为1.6 μm）比先前描述的甲基球菌物种（约1 μm）更大，能在28–53°C温度范围内生长，最适温度为40°C，pH 5.5–7.5，最适pH 6.5–7.0。菌株Мс7Т对NaCl的耐受性（1.5%，wt/vol）超过其他甲基球菌属物种。该甲烷氧化菌能在总盐含量高达25 g L^–1的培养基中生长。菌株Мс7Т的¹⁶S rRNA基因序列与M. geothermalis IM1T的相似性最高，为98.56%。菌株Мс7Т的完整基因组序列大小为4.0 Mbp，包含2个rrn操纵子、约3700个蛋白质编码基因，其中包括2个颗粒状甲烷单加氧酶（particulate methane monooxygenase, pMMO）基因簇拷贝和1个可溶性甲烷单加氧酶（soluble methane monooxygenase, sMMO）基因簇。DNA G+C含量为63.44%。菌株Мс7Т与M. geothermalis IM1T基因组序列的平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）为88.56%。基于表型和基因型差异的数量，研究人员提议将菌株Мс7Т（=VKM B-4034T）归属于甲基球菌属的一个新种，即M. magnus。

甲烷营养菌（methanotrophic bacteria）是一类能够以甲烷（CH₄）为唯一碳源和能源的需氧细菌，在全球甲烷排放控制中发挥关键作用。甲基球菌属（Methylococcus）是其中重要的类群，已有六个有效描述种，但多数成员对NaCl敏感，且部分模式株已丢失。此前研究从俄罗斯汉特-曼西斯克市附近一处垃圾填埋场覆盖土壤中分离到一株潜在新种菌株Mc7T，该菌株表现耐盐特性。为进一步明确其分类地位，研究人员系统比较了该菌株与已知甲基球菌属代表菌株的表型、生长和基因组特征。

研究人员以菌株Mc7T为对象，参考菌株为Mc. capsulatus Bath和MIR。通过不同NaCl浓度培养比较耐盐性，用分光光度计测定特定生长速率和生物量，采用蒽酮法测定胞内蔗糖和糖原含量，用纸片法测定抗生素敏感性。系统发育基因组学分析利用GTDB-Tk软件包和MEGA X构建基于120个通用单拷贝蛋白的系统发育树，用pyANI程序计算ANI值；功能基因组分析使用BlastKOALA和Anvi’o软件进行KEGG注释和菌株特异性基因鉴定。菌株Mc7T分离自该垃圾填埋场上层覆盖土壤（0–10 cm），该场地曾测得近地表甲烷通量达5.8 ± 1.2 g CH₄ m^–2 h^–1。

形态与表型特征。菌株Mc7T在mNMS/2培养基上形成直径3–4 mm的圆形凸起乳白色菌落，细胞为革兰氏阴性球菌和双球菌，直径1.60 ± 0.03 μm，大于已知甲基球菌物种。该菌株仅利用甲烷和甲醇作为碳源，氮源谱包括硝酸盐、铵盐、尿素、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲酰胺、酪蛋白氨基酸、蛋白胨和大气氮。最适生长温度40°C，最适pH 6.8，在mNMS/2培养基上最高特定生长速率为0.245 h^–1，对应倍增时间2.8 h，生物量生产力为33 mg L^–1 h^–1。抗生素敏感性试验显示，菌株Mc7T对四环素、氯霉素和林可霉素具有天然抗性，这种抗性谱在甲基球菌属中此前尚未报道。

耐盐性关键特征。比较分析显示，菌株Mc7T对NaCl的耐受阈值显著高于已知甲基球菌属菌株。在总盐约1.5 g L^–1的mNMS/2培养基中，Mc7T可在高达2%（wt/vol）NaCl浓度下生长，而菌株Bath和MIR的阈值分别为0.75%和1%。在富盐MAR培养基中，Mc7T的耐盐阈值提高至2.5% NaCl，对应总盐含量约29 g L^–1，接近海水盐度。随着培养基盐度从0升至1% NaCl，菌株Mc7T胞内蔗糖含量从20.6 mg g^–1绝对干重（ADW）逐渐下降至11.2 mg g^–1 ADW，而糖原含量则从7.7 mg g^–1 ADW积累至16.6 mg g^–1 ADW。这一负相关表明，盐胁迫下细胞可能从利用低分子量渗透保护物质转向合成高分子量储备聚合物，反映了一种可能涉及渗透稳态维持和碳通量再分配的独特机制。

系统发育基因组学分析。菌株Mc7T的基因组约4.0 Mb，覆盖深度217×，为单一环状染色体，不含质粒，G+C含量63.5%，共注释3877个基因，其中3749个编码蛋白质。基于120个通用单拷贝蛋白构建的系统发育树显示，Mc7T归属于Methylococcus属的系统发育簇，其最近亲缘菌株为Methylococcus sp. ANG，两者属于同一物种。菌株Mc7T与Mc. capsulatus TexasT、Mc. mesophilus 16-5T和Mc. geothermalis IM1T的ANI值分别为88.6%、91.11%和88.77%，均低于95%的物种分界阈值，支持其新种地位。

基因组编码的代谢潜能。菌株Mc7T基因组中含有2个完整的颗粒状甲烷单加氧酶（pMMO）基因簇，即两套pmoCAB操纵子，以及一个额外的pmoC基因拷贝；同时还含有mmoXYBZDC基因簇，编码可溶性甲烷单加氧酶（sMMO）。甲醇氧化方面，该菌株含有mxaFJIGIRACKLD基因簇和xoxFJ基因簇，分别编码Ca²⁺依赖型和镧系元素依赖型甲醇脱氢酶。甲醛氧化具备四氢叶酸和四氢甲烷蝶呤两条途径的完整基因。碳同化途径包括核酮糖单磷酸循环和丝氨酸途径的基因，并且具有丙酮酸羧化酶基因，可能为三羧酸循环提供回补。氮代谢方面，nif基因簇位于nifK和nifE之间含有三个未知功能基因。次级代谢方面，菌株Mc7T是已研究的甲基球菌属菌株中唯一具有蔗糖合成与降解完整基因簇的菌株，这可能与其耐盐性相关。此外，其基因组还含有编码C-P裂解酶复合物的13个基因簇（phnFFCEGHIJKLMNP）、卤代烷脱卤酶基因、甲硫醇和二甲砜代谢相关基因，以及乙酰乳酸脱羧酶基因簇。

菌株特异性基因。泛基因组分析鉴定出约160个菌株Mc7T特异性基因，主要编码未知功能蛋白，同时包括与细胞防御、应激反应、物质运输和基因组可塑性相关的蛋白。这些特异性基因中富含移动遗传元件，包括IS66、IS110和IS1595家族插入序列以及酪氨酸重组酶。此外，Mc7T基因组还编码III-A型CRISPR-Cas系统、多位点特异性DNA甲基转移酶和限制性内切酶组成的限制-修饰（R-M）系统，以及RelE/ParE和PemK/MazF家族的II型毒素-抗毒素（TA）模块，暗示其曾经历较强的噬菌体选择压力并具备多样化的抗噬菌体防御机制。

综上所述，菌株Mc7T在表型、生理和基因型上均与已知甲基球菌属物种存在显著差异，符合原核生物新种分类标准，因此研究人员将其命名为Methylococcus magnus sp. nov.。这是甲基球菌属中首个被描述的耐盐代表，扩展了对该属生态多样性和环境适应机制的认识。新种模式株为Mc7T（=VKM B-4034T），分离自俄罗斯汉特-曼西斯克自治区一座城市固体废物填埋场的覆盖土壤。