巴西东北部柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）的多相分类鉴定、铜敏感性及非芸香科替代寄主潜力研究

《Tropical Plant Pathology》：Molecular characterization and copper susceptibility of Xanthomonas citri subsp. citri strains obtained in Northeast Brazil

　　

亚洲型柑橘溃疡病（Asiatic citrus canker）于20世纪50年代首次在巴西东南部地区被记录，然而该病害直至近年才扩散至该国东北部的柑橘产区。因此，为探究该地区142株柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）的变异性，研究人员采用表型、分子、系统发育及病理学分析进行了多相分类鉴定（polyphasic characterization）。所有菌株均呈现一致的rep-PCR（重复序列PCR）图谱，并在甜橙（Citrus sinensis）、来檬（C. latifolia）和葡萄柚（C. paradisi）上引起典型的亚洲型柑橘溃疡病症状，被鉴定为致病型Xcc-A（pathotype Xcc-A）。基于gyrB（DNA旋转酶β亚基基因）、rpoD（RNA聚合酶σ亚基基因）、fyuA（TonB依赖性受体基因）和dnaK（分子伴侣蛋白dnaK基因）串联序列构建的贝叶斯推断（Bayesian inference）系统发育树，可将上述菌株准确鉴定为柑橘黄单胞菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri）。来自东北部不同州的代表性菌株呈现相同的生化图谱，对氧氯化铜（copper oxychloride）的敏感性高于氢氧化铜（copper hydroxide），且仅检测到copL基因。交叉接种实验表明，柑橘黄单胞菌柑橘亚种可在腰果（Anacardium occidentale）、巴西肖乳香（Schinus terebinthifolia）和芒果（Mangifera indica）叶片上引起病斑并存活超过10天。综上，研究结果表明，本研究所用的柑橘黄单胞菌柑橘亚种菌株基于rep-PCR和MLSA（多位点序列分析）表现出高度的遗传同质性，提示其种群结构以克隆为主，且铜抗性在当前所评估菌株中尚不常见。此外，研究人员证明非芸香科（non-Rutaceae）植物可作为该病原菌的暂时寄主。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

亚洲型柑橘溃疡病（Asiatic citrus canker）是由柑橘黄单胞菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri）引起的一种严重威胁巴西乃至全球柑橘产业的细菌性病害。该病害可为害叶片、枝条和果实，导致受害果实提早脱落而降低产量，并限制产区果品在其他地区的销售和流通。受污染的植物材料远距离调运是病害远距离传播的主要途径。该病害于1957年首次在巴西东南部的圣保罗州被报道，此后逐步扩散至中西部、北部、南部地区。然而，在巴西东北部地区，柑橘溃疡病直至2009年才首次在马拉尼昂州（Maranh?o）被发现，随后分别于2011年在塞阿拉州（Ceará）、2018年在皮奥伊州（Piauí）、2019年在北里奥格兰德州（Rio Grande do Norte）相继被检出。由于该病害在东北部地区的发生历史相对较短，关于该地区柑橘溃疡病菌群体的遗传变异、致病型组成、铜敏感性状况及潜在替代寄主范围等信息十分有限。鉴于铜基杀菌剂的化学防治是目前减轻柑橘溃疡病损失的主要手段，而持续使用铜制剂可能诱导铜抗性菌群的出现，因此亟需对东北部地区新近传入的菌株群体开展系统性鉴定。此外，巴西柑橘生产体系中常涉及间作和多样化农业生态系统，不同植物物种在同一产区共存，了解柑橘溃疡病菌的寄主范围对于降低柑橘园附近的初侵染源浓度具有重要意义。

**二、研究内容与总体结论**

研究人员对2019年至2021年间从巴西东北部北里奥格兰德州（Mossoró）、塞阿拉州（Limoeiro do Norte）和皮奥伊州（Teresina）的果园中采集的142株菌株，开展了包括生化、分子、系统发育及病理学分析在内的多相分类鉴定（polyphasic characterization），同时评估了代表性菌株对铜制剂的敏感性，并探究了非芸香科植物被人工接种感染的可能性。研究结果表明，巴西东北部新近传入的柑橘黄单胞菌柑橘亚种群体由致病型Xcc-A（pathotype Xcc-A）的克隆株系组成，遗传同质性极高；所评估菌株对铜制剂敏感，铜抗性相关基因copA和copB未被检出；此外，腰果、巴西肖乳香和芒果等非芸香科植物可作为该病原菌的暂时寄主。

**三、主要关键技术方法**

研究人员首先从具有典型柑橘溃疡病症状的来檬（cv. ‘Galego’）和甜橙（cv. ‘Pêra’）叶片及果实上进行病原菌分离，共获得142株菌株，保存于伯南布哥联邦农村大学（UFRPE）植物细菌学实验室的植物细菌培养物保藏中心。采用REP、ERIC和BOX-PCR三种引物对所有菌株进行rep-PCR（重复序列PCR）分析，基于Jaccard相似系数和UPGMA法构建树状图以评估菌株间的遗传关系。通过在不同柑橘品种（甜橙cv. ‘Pera’、来檬cv. ‘Tahiti’、葡萄柚cv. ‘Marsh’）叶片上进行致病性接种以确定致病型。从每个州随机选取2株菌（共6株），对gyrB（DNA旋转酶β亚基基因）、rpoD（RNA聚合酶σ亚基基因）、fyuA（TonB依赖性受体基因）和dnaK（分子伴侣蛋白dnaK基因）进行多位点序列分析（MLSA），采用贝叶斯推断（Bayesian inference）法基于串联序列构建系统发育树。利用Biolog GEN III系统（含94项生化测试）对6株代表性菌株进行代谢图谱分析。随机选取13株菌（北里奥格兰德州2株、塞阿拉州9株、皮奥伊州2株），在含不同浓度氢氧化铜（copper hydroxide）和氧氯化铜（copper oxychloride，0至400 mg/L）的NYDA培养基上评估铜敏感性，并利用特异性引物通过PCR检测copLAB基因簇中copA、copB和copL基因的存在情况。将6株代表性菌株交叉接种至巴西肖乳香（Schinus terebinthifolia）、腰果（Anacardium occidentale）、葡萄（Vitis vinifera cv. ‘Núbia’）、猪李（Spondias mombin）、芒果（Mangifera indica cv. ‘Espada’）和来檬（Citrus latifolia cv. ‘Tahiti’）幼苗叶片，评估潜伏期、病害严重度和病斑内细菌种群密度。

**四、主要研究结果**

**（一）病原菌分离与致病性验证**

从北里奥格兰德州（11株）、塞阿拉州（96株）和皮奥伊州（24株）的来檬以及皮奥伊州甜橙（6株）上共获得142株菌株，所有菌株在NYDA培养基上呈现黄色、凸起、黏稠的菌落形态，回接甜橙叶片后均引起典型的亚洲型柑橘溃疡病症状，即具有褪绿晕圈边缘的凸起病斑（erumpent lesions），完成了科赫氏法则验证。

**（二）rep-PCR分析**

142株菌株的rep-PCR分析（REP、ERIC和BOX-PCR）共产生34条可重复条带（100至3000 bp），其中REP引物14条、BOX引物11条、ERIC引物10条。基于三种引物组合数据的UPGMA聚类分析显示，所有菌株在100%相似性水平上聚为单一类群，表明该群体具有极高的遗传同质性。

**（三）致病型鉴定**

所有142株菌株在甜橙、来檬和葡萄柚叶片上均具有致病性，接种后4天出现水渍状区域，9至18天后发展为具有黄色晕圈的凸起病斑，且未观察到过敏反应（hypersensitive response，HR）。该病理学特征符合致病型Xcc-A的典型表现，即在所有柑橘种类上均能引起溃疡症状。

**（四）多位点序列分析（MLSA）**

基于BLASTn比对，6株代表性菌株（CCRMXC09、CCRMXC15、CCRMXC35、CCRMXC69、CCRMXC122、CCRMXC130）的dnaK、fyuA和rpoD基因序列与柑橘黄单胞菌柑橘亚种模式菌株（ICMP 24^T）及其他菌株（ICMP 7493和ICMP 21）的对应序列具有100%一致性，gyrB基因序列与ICMP 24^T和ICMP 7493具有100%一致性，与ICMP 21具有99.86%一致性。基于dnaK、fyuA、gyrB和rpoD四个基因串联序列（2919 bp）构建的贝叶斯推断系统发育树将6株菌与模式菌株ICMP 24^T以1.0的后验概率聚于同一分支，精确鉴定了其分类地位。

**（五）代谢图谱分析**

6株代表性菌株在Biolog GEN III系统上呈现完全一致的生化反应图谱，均对糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖等44种底物呈阳性反应，对水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖等55种底物呈阴性反应，表现出极高的代谢同质性。

**（六）铜敏感性及copLAB基因簇检测**

13株代表性菌株对氧氯化铜和氢氧化铜均表现敏感，分别在125 mg/L和300 mg/L浓度下被完全抑制，均远低于巴西推荐的最低田间使用浓度（氧氯化铜1000 mg/L，氢氧化铜750 mg/L），但对氧氯化铜的敏感性高于氢氧化铜。PCR检测结果显示，所有菌株均仅扩增出copL基因片段（650 bp），copA和copB基因片段均未被检出。由于CopL蛋白仅参与copA和copB基因的表达调控，单独存在不足以赋予铜抗性，这解释了菌株对铜敏感的原因。

**（七）非芸香科替代寄主的感染性**

交叉接种实验表明，菌株与寄主间在潜伏期上无显著交互作用。所有菌株在腰果（接种后2天）、猪李（3天）、巴西肖乳香（3天）、芒果（3天）和来檬（4天）叶片上均可引起水渍状病斑。接种后12天，腰果叶片呈现不规则暗色病斑，巴西肖乳香叶片出现不规则褐色斑点，芒果叶片呈现带有轻微黄色晕圈的暗色病斑，而来檬叶片则表现出典型的柑橘溃疡病凸起症状；猪李和葡萄叶片未表现任何症状。在严重度和种群密度方面，菌株与寄主间存在显著交互作用（p = 0.001）。除菌株CCRMXC09在巴西肖乳香、芒果和来檬上引起相似严重度外，其余菌株在来檬上的病斑严重度（16.05至42.81 mm²）均显著高于腰果（10.14至22.18 mm²）、巴西肖乳香（8.36至20.19 mm²）和芒果（9.92至15.96 mm²）。同样，所有菌株在来檬病斑内的种群密度（2.5至3.8 × 10⁶ CFU/病斑）均显著高于腰果（0.7至2.9 × 10⁴ CFU/病斑）、巴西肖乳香（2.4至9.0 × 10⁴ CFU/病斑）和芒果（2.0至7.0 × 10³ CFU/病斑）。此外，从上述寄主回分离的菌株与原接种菌株具有一致的rep-PCR图谱，确认了病原菌身份并完成了科赫氏法则验证。

**五、讨论总结与研究结论**

研究表明，巴西东北部地区柑橘溃疡病菌群体呈现高度克隆化的种群结构，这与此前在巴西中西部、东南部和南部地区报道的菌株遗传单一性一致，暗示该病原菌极有可能通过受感染的苗木从其他已发病州传入东北部产区。所有菌株均属于致病型Xcc-A，这是目前巴西田间唯一流行的致病型（致病型Xca-C曾在圣保罗州被检测到，但已不再与田间暴发相关联）。MLSA分析进一步以高后验概率支持了菌株的分类地位。代谢图谱的高度一致性与此前在马来西亚西部地区柑橘黄单胞菌柑橘亚种中观察到的低代谢可塑性特征相符。

在铜敏感性方面，虽然巴西目前尚无铜抗性菌株的报道（巴拉那州曾检出可在中等铜浓度下生长的耐受菌株），但本研究所有菌株均对铜敏感，且仅检测到copL基因而缺乏copA和copB基因，这为当前东北部产区继续使用铜基杀菌剂进行病害管理提供了科学依据。值得注意的是，菌株对氧氯化铜的敏感性高于氢氧化铜，这一差异信息对田间药剂选择具有参考价值。

交叉接种实验揭示了柑橘溃疡病菌潜在的生态学风险：尽管该病原菌在腰果、巴西肖乳香和芒果等非芸香科植物上的种群密度显著低于在柑橘寄主上的密度，但其可在这些植物组织中存活超过10天，表明这些植物可作为病原菌的暂时寄主（temporary host）。虽然rep-PCR检测到的是克隆群体，但各菌株在不同替代寄主上的毒力和种群密度仍表现出显著差异，这可能归因于某些致病基因的点突变（point mutations），这些微小变化不足以改变rep-PCR图谱。

基于生化、基因组学、系统发育和病理学特征，研究人员得出结论：巴西东北部新近传入的柑橘黄单胞菌柑橘亚种群体目前由致病型Xcc-A的克隆株系组成；所分析菌株均为铜敏感型，未检出对铜抗性至关重要的copA和copB基因，表明铜抗性相关基因在该群体中目前尚不常见；此外，巴西肖乳香、腰果和芒果树可作为柑橘黄单胞菌柑橘亚种的暂时寄主，这一发现对柑橘产区的病害综合管理策略制定具有重要参考价值。