Wistar大鼠尿液中2-单氯丙烷-1,3-二醇（2-MCPD）代谢物的鉴定、定量及其代谢途径的综合解析

《Archives of Toxicology》：Characterization and quantitation of urinary metabolites of 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD) in Wistar rats

　　

2-单氯丙烷-1,3-二醇（2-MCPD）的脂肪酸酯是含脂肪和盐的食品在热加工过程中形成的加工污染物。关于2-MCPD代谢的有限信息阻碍了对大鼠经口灌胃给予溶解于水的2-MCPD 28天后，在骨骼肌、心肌及肾脏中观察到的毒性效应机制的探究。本研究的目的是扩展2-MCPD在大鼠体内的代谢方案。经口灌胃给予[¹³C₃]2-MCPD（30 mg/kg体重；bw）或2-MCPD（3或30 mg/kg bw）后，在0–8 h、8–24 h和24–48 h时间段收集尿液样本。通过¹³C核磁共振（NMR）波谱和高分辨质谱（HRMS）鉴定新型代谢物，并通过同位素稀释气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对最丰富的代谢物进行定量分析。主要化合物为2-MCPD本身及其氧化产物2-氯羟基丙烯酸（2-ClHA）。八种代谢物为首次检出。结合反应产物为2-MCPD硫酸酯和2-MCPD葡萄糖醛酸苷。谷胱甘肽结合物降解后形成的六种代谢物为：硫代二甘醇酸（TDGA）、亚硫酰基二甘醇酸（TNDGA）、3-(S-羧甲基)巯基乳酸（CMMLA）、S-(羧甲基)-半胱氨酰甘氨酸（CMCG）、N-乙酰基-S-(1-羧基-2-羟乙基)-半胱氨酸（CHEMA）和2-[(2-羧基-2-氧代乙基)硫烷基]羟基丙烯酸（2-COSHA）。在低剂量3 mg/kg bw给药后48 h内收集的雄性（m）和雌性（f）尿液中，四种主要化合物的平均排泄比率分别为：2-MCPD本身（m: 12.5%, f: 11.6%）、2-ClHA（m: 30.4%, f: 26.0%）、TDGA（m: 8.5%, f: 8.1%）和2-MCPD硫酸酯（m: 0.19%, f: 0.23%）。总之，已鉴定的代谢物至少覆盖了给药剂量的51.6%（雄性）或45.9%（雌性），这使得研究人员能够提出一个全面的代谢途径方案。鉴于2-MCPD及其每种代谢物均可能发挥毒性作用，有两对代谢物因其与谷胱甘肽的反应活性而尤为突出：2-氯乙醛/2-氯乙酸以及2-氯乳醛/2-ClHA。

**论文解读**

**研究背景与科学问题**

2-单氯丙烷-1,3-二醇（2-MCPD）脂肪酸酯是一类在食品热加工过程中形成的加工污染物，主要存在于精炼植物油中，尤其在脱臭工序中产生。其生成依赖于氯离子的存在，并在低pH值和高温条件下被促进，在70至220°C范围内随温度升高而增加。在各类植物油中，棕榈油中的2-MCPD酯含量最高。因此，2-MCPD酯广泛存在于多种食品中，尤其以烘焙食品、油炸产品和婴儿配方食品中的含量较为突出。基于体外人类肠道Caco-2细胞研究及胰腺脂肪酶孵育实验，研究者推测2-MCPD酯在摄入后于胃肠道中完全水解，游离2-MCPD被定量吸收，这一过程与其异构体3-单氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）的酯类相似。

相比于3-MCPD已较为充分的毒性研究数据——短期暴露降低雄鼠精子活力，慢性暴露诱导雄性大鼠肾病变及肾小管增生，并被国际癌症研究机构（IARC）归类为可能对人类致癌——2-MCPD的毒性数据十分有限。在欧洲食品安全局（EFSA）的评估中，SD大鼠28天重复剂量研究发现，每日16 mg 2-MCPD/kg bw剂量即导致骨骼肌和心肌毒性效应，表现为心肌横纹肌损伤并导致心力衰竭；30 mg/kg bw/day剂量下观察到肾毒性效应，包括尿量增加、肾脏重量升高及近端肾小管细胞胞质空泡化。后续28天和90天重复剂量毒性研究进一步确认心脏为2-MCPD毒性的主要靶器官，肾脏为次要靶器官。转录组学和蛋白质组学分析显示，2-MCPD处理后大鼠心脏中免疫应答上调，能量代谢和心脏结构相关通路下调，伴随心脏保护性多不饱和脂肪酸氧化代谢产物（oxylipins）的减少，共同导致坏死增加、炎症加剧及随后的心脏纤维化。然而，2-MCPD代谢信息的严重缺乏阻碍了对其毒性机制的深入理解。此前仅有一项受控人体暴露研究报道了尿液中2-氯羟基丙烯酸（2-ClHA）的检出，约占摄入剂量的34%，另约14.3%以原形排出，合计约48.3%，表明仍有相当大比例的2-MCPD代谢途径不明。因此，本研究旨在系统鉴定并定量大鼠尿液中2-MCPD的代谢物，以构建全面的代谢途径方案。

**研究开展与技术方法**

研究人员以雌性和雄性Wistar大鼠为模型动物（每组3只），通过灌胃给予单次剂量的2-MCPD（3或30 mg/kg bw）或[¹³C₃]2-MCPD（30 mg/kg bw），对照组给予溶剂（10%乙醇），在代谢笼中分别收集0–8 h、8–24 h和24–48 h时间段的尿液样本。该动物实验经下萨克森州消费者保护和食品安全办公室（LAVES）批准。

技术方法方面，研究人员首先采用一维和二维¹³C核磁共振（NMR）波谱，特别是INADEQUATE（Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment，天然丰度双量子转移实验）技术，利用[¹³C₃]2-MCPD中相邻¹³C原子之间的偶联信号来识别代谢物中的碳-碳连接关系。其次，利用高分辨质谱（HRMS）在电喷雾负离子模式下进行数据依赖性采集（dd-MS²），通过比对2-MCPD处理组与[¹³C₃]2-MCPD处理组尿液样本中同位素异位体的保留时间、信号强度、异构体分布和碎裂图谱，确认代谢物的结构归属。定量分析方面，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定原形2-MCPD（经苯硼酸衍生化），采用离子对色谱-串联质谱（IPC-MS/MS）测定2-ClHA和TDGA，采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定2-MCPD硫酸酯。

**研究结果**

*一维和二维¹³C NMR波谱鉴定代谢物*

[¹³C₃]2-MCPD给药后大鼠尿液浓缩样本的¹H-去耦¹³C NMR谱显示，由于¹³C的天然丰度极低（~0.012%），内源性化合物仅呈单峰，而由[¹³C₃]2-MCPD形成的代谢物则因相邻¹³C原子间的偶联而呈双峰（d）或双双峰（dd），从而可被特异性识别。INADEQUATE谱进一步揭示了¹³C原子间的连接关系。其中，δ 60.41、63.02和70.37 ppm处的三碳体系被归属为2-MCPD硫酸酯（M3），其结构经合成标准品的¹³C NMR谱确认。此外，INADEQUATE谱还指示了2-MCPD（M1）、2-ClHA（M2）、TDGA（M5）、TNDGA（M6）以及代谢物M4（推测为谷胱甘肽结合来源）的存在。但由于2-MCPD与2-ClHA的¹³C信号严重重叠，以及GSH来源分子片段中¹³C天然丰度极低，这些初步归属需经HRMS进一步确认。

*HRMS非靶向鉴定2-MCPD代谢物*

通过HRMS在ESI^?模式下的数据依赖性采集，研究人员共鉴定出十种2-MCPD代谢物（M1–M10）。其中，2-ClHA（M2）通过检测m/z 122.9840的前体离子及m/z 87.0073的特征碎片得到确认，其[¹³C₃]同位素异位体进一步验证了结构归属。2-MCPD硫酸酯（M3，m/z 188.9623）显示出特征性硫酸氢根阴离子碎片（m/z 96.9586）和HCl中性丢失产物（m/z 152.9852）。M4被鉴定为2-ClHA的硫醚氨酸（CHEMA），即N-乙酰基-S-(1-羧基-2-羟乙基)-L-半胱氨酸。TDGA（M5）通过前体离子m/z 148.9901及CO₂中性丢失碎片（m/z 105.0000）得到确认；其同位素标记形式[¹³C₂]TDGA显示出两种不同CO₂丢失途径，表明TDGA分子中仅一侧碳链来源于[¹³C₃]2-MCPD，另一侧源于GSH。TNDGA（M6）作为TDGA的氧化产物也得到确认。NMR未检测到的代谢物M7–M10也在HRMS分析中得到鉴定：M7为2-MCPD葡萄糖醛酸苷（m/z 285.0378），显示出葡萄糖醛酸苷的特征碎片（m/z 175.0239和113.0230）；M8为S-(羧甲基)-半胱氨酰甘氨酸（CMCG，m/z 235.0383）；M9为3-(S-羧甲基)巯基乳酸（CMMLA，m/z 179.0012）；M10为2-[(2-羧基-2-氧代乙基)硫烷基]羟基丙烯酸（2-COSHA），其色谱图显示两个主要峰，提示可能存在一对对映异构体。ESI⁺模式下未检出任何带正电荷的代谢物。

*尿液代谢物的定量分析*

GC-MS和LC-MS/MS定量结果显示，在低剂量组（3 mg/kg bw）48 h尿液收集期内，原形2-MCPD排泄率雄性为12.5%，雌性为11.6%；高剂量组（30 mg/kg bw）中原形排泄率显著升高（雄性19.5%，雌性19.9%），提示可能存在代谢饱和。2-ClHA是最主要的尿液代谢物，高剂量组雄性排泄率（30.3%）显著高于雌性（20.7%），低剂量组无显著性别差异。TDGA排泄率在7.5%至8.8%之间，未见剂量依赖性或性别差异。2-MCPD硫酸酯排泄率较低（低剂量组：雄性0.19%，雌性0.23%），高剂量组略有升高。关于[¹³C₂]草酸的靶向分析表明，在[¹³C₃]2-MCPD处理大鼠的18份尿液样本中，仅两份信号高于定量限（LOQ），估计草酸仅占给药剂量的约0.01%，表明草酸并非2-MCPD的重要代谢产物。

**讨论与结论**

本研究表明，2-MCPD在大鼠体内的代谢途径与3-MCPD基本一致，包括ADH/ALDH催化的氧化反应、SULT催化的硫酸酯结合反应、UGT催化的葡萄糖醛酸结合反应以及GSH结合反应，但各途径的定量贡献存在显著差异。48 h内尿液代谢物总回收率在低剂量组为给药剂量的45.9%（雌性）和51.6%（雄性），约为3-MCPD相应值（约9.5%–9.9%）的四至五倍。原形2-MCPD的排泄率约为3-MCPD的四倍，2-ClHA的排泄率远高于3-MCPD的对应氧化产物β-氯乳酸（β-ClLA），TDGA的生成量也显著高于3-MCPD处理组。2-MCPD未检测到与3-MCPD重要代谢物2,3-二羟丙基硫醚氨酸（DHPMA）结构类似的硫醚氨酸，这可能是由于2-MCPD中氯原子邻位存在两个烷基的空间位阻效应和正诱导效应（+I效应）降低了S_N2亲核取代反应活性；而氧化为2-ClHA后，α-碳上的羧基具有负诱导效应（-I效应），促进了GSH结合。关于约50%未回收剂量的去向，可能涉及经粪便或呼气排泄、脱氯后掺入内源性分子、活性中间体与细胞亲核物质结合或直接掺入磷脂膜等途径，需通过[¹⁴C]2-MCPD整体放射自显影进一步探究。

研究结论：通过HRMS和¹³C NMR对2-MCPD或[¹³C₃]2-MCPD给药后大鼠尿液代谢物的系统鉴定，研究人员提出了一个全面的代谢途径方案。除已在人体研究中报道的2-MCPD和2-ClHA外，首次描述了八种代谢物：两种结合产物（2-MCPD硫酸酯和2-MCPD葡萄糖醛酸苷）以及六种GSH结合后降解产物（CMCG、CMMLA、CHEMA、2-COSHA、TDGA、TNDGA）。在生物标志物选择方面，2-MCPD本身仍是最佳暴露生物标志物，TDGA和2-ClHA因缺乏特异性而受限。含硫代谢物的分布模式指示了两对经GSH结合解毒的代谢物对：2-氯乙醛/2-氯乙酸和2-氯乳醛/2-ClHA，这提示二者具有略高的反应活性，是未来在肾脏和心肌细胞培养模型中开展毒性作用机制研究的候选对象。