虹鳟肠道屏障从未成熟到成熟上皮：结构动态与转录程序的解析

《Veterinary Research》：From immature to mature epithelium: unveiling structural dynamics and transcriptional programs in rainbow trout intestinal barrier

　　

肠道上皮对于养殖鱼类的营养吸收、免疫防御和屏障功能至关重要。然而，鲑科鱼类肠道上皮发育和成熟的分子机制仍未被充分表征，这阻碍了解决水产养殖中普遍存在的肠道健康问题的能力。在本研究中，研究人员使用RTgutGC细胞系构建了一个上皮成熟模型，旨在表征虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的整体转录程序。研究人员评估了体外培养条件，以生成具有高跨上皮电阻（TEER = 75.8 Ω × cm²）、低渗透性（6.2 × 10^–6 cm/s）和明确顶端特化结构（包括微绒毛样结构和这些结构的簇（刷状缘））的极化上皮屏障。未成熟（接种后第7天，7 dps）与成熟（28 dps）上皮之间的比较转录组分析揭示了3,817个差异表达基因（DEGs）。功能富集分析表明，成熟的特征是增殖和核糖体通路的下调，以及屏障功能关键过程（包括跨膜转运、蛋白水解、细胞黏附、细胞外基质组织和紧密连接组装）的协同上调。研究人员鉴定了一个包含60个基因的核心基因集，作为上皮成熟的指标，涵盖溶质转运体（slc26a6、slc43a2）、紧密连接蛋白（tjp1、cldn1、cldn3、cldn5、cldn18等）以及微绒毛形成和极化所必需的结构组分（cdhr5b、pard6a）。通过整合超微结构、功能和转录组数据，本研究为未来体外肠道发育和成熟的机制研究建立了框架。这套成熟上皮指标具有多种应用前景，例如设计营养和药理学干预措施以改善养殖鱼类的肠道健康和抗逆性。

**研究背景与目的**

水产养殖被预测到2032年将供应超过60%的水产食品消费，但其可持续增长面临传染病暴发和鱼粉鱼油短缺等挑战。肠道上皮通过营养吸收、免疫应答和选择性屏障功能，对动物生产性能至关重要。尽管哺乳动物肠道生理已广泛研究，但硬骨鱼类（teleost）的相关调控机制仍不清楚，尤其是鲑科鱼类的上皮发育和成熟过程缺乏分子水平的表征，依赖斑马鱼模型和哺乳动物标志物不足以捕捉物种特异性特征。RTgutGC细胞系来源于虹鳟（Oncorhynchus mykiss）远端肠道，能在可渗透支持物上形成极化单层，已被用于屏障功能、细胞毒性等研究，但尚未用于上皮成熟过程的机制探索。为此，研究人员利用RTgutGC细胞系建立体外上皮成熟模型，整合超微结构、功能和转录组数据，以揭示虹鳟肠道屏障成熟的结构动态和转录程序。

**主要技术方法**

研究人员从Luis Mercado实验室（智利）获得RTgutGC细胞系（实验使用传代95-115），将其接种于聚酯（PET）Transwell?插入物上，在含20%胎牛血清（FBS）的L-15培养基中培养。通过跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）测量评估屏障完整性，通过Lucifer Yellow（LY）渗透实验评估旁细胞通透性；利用扫描电镜（scanning electron microscopy, SEM）观察超微结构，免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1以评估极性；对未成熟（7 dps）和成熟（28 dps）上皮进行RNA-seq测序（DNBSEQ-G400平台），用limma分析差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

**研究结果**

*肠道上皮屏障的完整性与功能性*：通过比较种植密度和FBS浓度，确定最佳条件为125,000 cells/cm²、20%FBS、PET膜。在此条件下，TEER随时间上升，于28 dps达到平台期（75.8 Ω × cm²），LY渗透率为6.2 × 10^–6 cm/s，表明形成了高完整性、低通透性的功能性上皮屏障。

*肠道上皮屏障的成熟与极性*：SEM显示，1 dps时细胞呈现丝状伪足和隧道纳米管样结构，微绒毛稀少；7 dps时出现均一的微绒毛样结构但无聚集；28 dps时微绒毛样结构形成复杂簇，且长度（从1.47 ± 0.44 μm降至1.03 ± 0.58 μm）和宽度（从0.75 ± 0.22 μm降至0.24 ± 0.06 μm）显著减小。ZO-1在7 dps时分布弥散，28 dps时呈顶端定位，结合DAPI核位于基底侧，证实了单层柱状上皮的极性。定量分析显示28 dps上皮约72.4%区域为连续单层，其余为局灶双层。

*肠道上皮极化和成熟的基因表达谱与转录调控*：RNA-seq的层次聚类和MDS分析显示未成熟与成熟样本明显分离。共鉴定3,817个DEGs，其中2,496个上调、1,321个下调。下调基因富集于rRNA加工、核糖体生成、细胞周期等增殖相关通路；上调基因富集于跨膜运输、蛋白水解、细胞黏附、细胞外基质组织、紧密连接组装等成熟相关通路。进一步筛选出60个成熟指标基因，包括溶质转运体（slc26a6、slc43a2）、紧密连接蛋白（tjp1、cldn1、cldn3、cldn5、cldn18等）和微绒毛形成相关基因（cdhr5b、pard6a等），分为细胞外基质与细胞行为、细胞黏附、上皮结构三类。

**讨论与结论**

讨论指出，优化条件下获得的TEER值高于该细胞系既往报道的25–40 Ω × cm²，但仍远低于哺乳动物Caco-2模型（>300 Ω × cm²），反映了鱼类与哺乳动物屏障的固有生理差异。28 dps的成熟时间比Caco-2的21 dps更长，可能与冷水鱼类代谢率低有关。确认了单层为主的结构后，作者认为该模型适合研究肠道上皮成熟。SEM还观察到一种直径约1.56 μm的顶端玫瑰花结样结构，其形态与初级纤毛基部类似，但直径更大，作者认为需要进一步分析。转录组富集分析结果与已知上皮分化特征一致，并体现了肉食性鱼类的特征，如氨基酸转运体和蛋白酶表达上调，而非斑马鱼模型中的脂质、碳水化合物代谢为主。研究结论：该工作解析了虹鳟肠道上皮成熟的结构和转录基础，揭示了协调屏障形成和功能特化的遗传程序，为设计营养和药理学干预措施改善养殖鱼类肠道健康提供了临床前体外平台，也可用于评估营养方案、病原挑战和新养殖条件对上皮完整性、修复机制和屏障功能的影响。