《Medical Oncology》：Differential STING and p53 expression in epidermodysplasia verruciformis-associated versus non-EV cutaneous squamous cell carcinomas
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表皮发育不良疣（Epidermodysplasia verruciformis，EV）是一种罕见的遗传性皮肤病，以持续性皮肤β型人乳头瘤病毒（β-human papillomavirus，β-HPV）感染和皮肤鳞状细胞癌（cutaneous sq
摘要专业翻译
表皮发育不良疣（Epidermodysplasia verruciformis，EV）是一种罕见的遗传性皮肤病，以持续性皮肤β型人乳头瘤病毒（β-human papillomavirus，β-HPV）感染和皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）风险增加为特征。环状GMP-AMP合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）–干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）通路将胞质DNA感知、基因组不稳定性和固有免疫激活联系起来，但该通路在EV相关cSCC中的表达尚不明确。研究人员在包含47例EV相关和83例非EV cSCC的组织微阵列中定量检测了STING、p53和BCL2的免疫组化表达。肿瘤H评分取有效芯的中间值；主要比较采用患者聚类的广义估计方程（generalized estimating equations，GEE）。EV相关肿瘤中STING表达较高（中位H评分192.4 vs. 149.5）；在分级校正的GEE中，EV状态与+37.2单位的差异相关（95%置信区间[CI] 23.4–51.0；p < 0.001）。EV–非EV的STING差异随组织学分级而变化（交互作用p = 0.0067），其中1级肿瘤的估计差异最大。EV肿瘤中p53表达也较高（97.7 vs. 36.3；校正差异+43.8，95% CI 18.8–68.8；p < 0.001），且EV肿瘤属于更高p53三分位组的几率更高（比值比[odds ratio，OR] 3.54，95% CI 1.98–6.32；p < 0.001）。BCL2保持低表达，且与EV无显著关联（校正差异?1.93，95% CI ?4.84至0.98；p = 0.193）。在校正组织学分级、EV状态和患者聚类后，STING与p53仍呈正相关。这些发现定义了EV相关cSCC中改变的STING蛋白表达表型，伴随p53表达升高但无独立的BCL2关联，并支持对cGAS–STING信号进行功能研究。
论文解读
一、研究背景与研究目的
表皮发育不良疣（epidermodysplasia verruciformis，EV）是一种罕见的遗传性皮肤病，以终身易感皮肤β型人乳头瘤病毒（β-human papillomavirus，β-HPV）感染、播散性扁平疣样皮损及皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）风险显著增加为特征，尤其好发于日光暴露部位。既往遗传学研究已将EV与TMC6/TMC8基因的功能缺失变异及CIB1–EVER1–EVER2复合体的破坏联系起来，支持角质形成细胞内在免疫缺陷导致β-HPV持续感染和病毒相关癌变的模型。
环状GMP-AMP合酶（cGAS）–干扰素基因刺激因子（STING）通路是该研究背景下的关键通路，因为它将胞质DNA感知、固有免疫激活和基因组应激的细胞反应联系起来。cGAS检测胞质双链DNA并激活STING依赖的I型干扰素信号；胞质DNA也可能来源于染色体不稳定产生的微核，从而将DNA损伤与固有免疫激活连接起来。在维持病毒附加体的HPV阳性角质形成细胞模型中，cGAS–STING信号对胞质DNA保持响应，且cGAS参与DNA损伤诱导的凋亡，支持HPV持续感染、固有DNA感知和基因毒性应激之间存在功能性交叉。然而，EV相关cSCC相对于非EV cSCC的STING蛋白定量表达此前缺乏系统表征。
p53为EV相关cSCC中的DNA损伤反应提供了补充背景。TP53是原发性cSCC中最常突变的驱动基因之一，EV相关病毒性皮肤肿瘤中也已记录到异常p53表达伴随TP53突变。BCL2作为额外的凋亡相关标志物被纳入评估；在此背景下，β-HPV E6蛋白（包括与EV典型相关的HPV-5和HPV-8型）可降解促凋亡的BCL2家族成员Bak并保护角质形成细胞免受UVB诱导的凋亡。既往免疫组化研究在包括三个非致瘤性EV病变在内的更广泛的角化细胞增生性病变谱系中评估了p53和BCL2，但未专门比较EV相关cSCC与非EV cSCC。
因此，本研究旨在比较EV相关与非EV cSCC之间STING、p53和BCL2的免疫组化表达差异，通过数字免疫组化定量分析两组肿瘤的组织微阵列，评估组间差异、组织学分级相关模式及标志物间的相关性。
二、主要技术方法
本研究采用回顾性队列设计，纳入来自巴西圣保罗大学医学院皮肤病学系皮肤病理学实验室的存档cSCC标本，包括47例EV相关cSCC和83例非EV、非免疫抑制cSCC。EV诊断基于儿童期起病的播散性扁平疣样皮损的典型临床病史及相符的组织病理学发现。47例EV肿瘤中有46例可获得患者关联信息，对应13例患者；部分EV患者贡献多个肿瘤，而每个非EV肿瘤来自不同患者。既往分子研究已在13例EV患者中的9例确认β-HPV感染，这些患者贡献了46例肿瘤中的37例。
免疫组化在福尔马林固定、石蜡包埋的TMA切片上进行，使用抗TMEM173/STING抗体、抗p53克隆Bp53-11和抗BCL2克隆124。STING采用Novolink Max Polymer检测系统，p53和BCL2在Ventana自动化IHC/ISH平台上染色。每个标志物的EV和非EV样本在同一染色批次、相同实验条件下进行免疫染色。
免疫染色TMA玻片使用Aperio ScanScope CS系统数字化，并在QuPath v0.6.0中分析。TMA芯通过dearrayer工具识别并人工检查组织充分性和伪影。图像分析对EV/非EV分组分配设盲，并限定在人工勾画的肿瘤区域内。标志物特异性评分使用核DAB光密度（p53）和胞质DAB光密度（STING和BCL2）。检测到的肿瘤细胞使用统一应用于所有切片的固定DAB光密度阈值分类为阴性、1+、2+或3+。H评分按每个芯计算为1×(弱阳性百分比)+2×(中度阳性百分比)+3×(强阳性百分比)，范围0–300。检测肿瘤细胞少于100个的芯被排除，每个标志物的肿瘤水平H评分定义为有效芯的中位数。
统计分析以肿瘤为主要观察单位。由于部分EV患者贡献多个肿瘤，主要推断性比较采用以患者身份为聚类变量的广义估计方程（GEE）模型以考虑患者内相关性。EV–非EV连续H评分差异在未校正和组织学分级校正模型中评估。多变量模型额外校正活检年龄、性别、组织学分级和解剖部位。通过EV×分级交互项评估组织学分级的效应修饰。EV状态与STING和p53三分位组的关联使用聚类感知有序逻辑回归评估，STING与p53 H评分的关联使用患者聚类GEE模型评估。敏感性分析包括患者水平聚合、限制为至少两个有效芯的肿瘤、年龄重叠分析、替代跨芯聚合方法及原始未聚类肿瘤水平比较。Benjamini–Hochberg错误发现率校正应用于预定义的检验家族内，统计学显著性设为p < 0.05。
三、研究结果
STING表达在EV相关cSCC中升高且随组织学分级变化
STING表达在EV肿瘤中高于非EV肿瘤（中位H评分192.4 [IQR 161.9–211.8]，n = 44 vs. 149.5 [129.2–173.9]，n = 78）。在分级校正的患者聚类GEE中，EV–非EV差异为+37.2 H评分单位（95% CI 23.4–51.0；p < 0.001）。EV–非EV的STING差异随组织学分级而变化（EV×分级Wald χ2(3) = 12.20，p = 0.0067）。模型估计的差异在原位癌为+43.8 H评分单位、G1为+72.2、G2为+22.2、G3为+23.8；G1效应在Holm校正后显著超过G2和G3（p = 0.0138和p = 0.0366）。
p53表达在EV相关cSCC中升高且富集于高三分位组
p53在EV肿瘤中同样较高（97.7 [38.4–147.8]，n = 43 vs. 36.3 [12.7–89.6]，n = 83；校正差异+43.8，95% CI 18.8–68.8；p < 0.001）。p53三分位分布也因EV状态而异，EV肿瘤在高三分位组富集（53.5% vs. 22.9%）而在低三分位组减少（18.6% vs. 41.0%）。聚类感知有序回归显示EV肿瘤属于更高p53三分位组的几率更高（OR 3.54，95% CI 1.98–6.32；p < 0.001），分级校正后仍持续。p53未观察到显著的EV×分级交互作用（p = 0.162）。
BCL2表达低且与EV无独立关联
BCL2在两组中均保持低表达且无显著差异（2.47 [0.74–7.06]，n = 44 vs. 4.44 [1.61–9.90]，n = 82；校正差异?1.93，95% CI ?4.84至0.98；p = 0.193）。
STING与p53呈正相关
STING和p53 H评分呈正相关（Spearman ρ = 0.44），该关联在校正分级、EV状态和患者聚类后仍持续（p = 0.00145）。
多变量模型与敏感性分析
在校正年龄、性别、组织学分级和解剖部位的多变量患者聚类模型中，EV状态仍与更高的STING（+49.4 H评分单位，95% CI 27.5–71.3；p < 0.001）和p53（+48.8，95% CI 23.8–73.7；p < 0.001）相关，而BCL2仍无显著性。患者水平聚合、年龄重叠、≥2有效芯和替代跨芯聚合敏感性分析结果一致。
四、讨论与结论总结
本研究通过数字H评分定量和跨有效TMA芯的每肿瘤聚合，评估了EV相关cSCC与非EV cSCC对照中STING、p53和BCL2的免疫组化表达。STING是主要发现，EV相关肿瘤中表达更高，且存在显著的EV×组织学分级交互作用。p53表达在EV肿瘤中也较高，而BCL2与EV无独立关联。STING和p53在校正组织学分级、EV状态和患者聚类后仍呈正相关。
讨论部分指出，STING表达升高是EV与非EV肿瘤之间最一致的差异，且EV–非EV效应随组织学分级变化，G1肿瘤中估计差异最大。cGAS–STING通路是胞质DNA的核心固有免疫传感器，胞质DNA可来源于病毒感染或宿主基因组不稳定（包括异常有丝分裂产生的微核），两种触发因素在EV中均具有生物学相关性。然而，总STING免疫组化测量的是蛋白丰度而非功能性通路激活；β-HPV-8 E6可减少STING磷酸化并减弱角质形成细胞暴露于胞质DNA时的下游固有免疫信号，因此STING丰度增加并不意味着下游信号完整。
p53表达升高可能反映细胞应激稳定的野生型p53或突变型p53的积累，但p53免疫组化无法区分二者，且存档材料无法进行测序。STING与p53的正相关不确立直接共调控，但与此前实验证据一致：p53激活可增加STING表达，而突变p53可破坏STING–TBK1–IRF3信号；该关联也与共享的DNA损伤相关或衰老相关应激相容。
研究结论为：EV相关cSCC显示以STING升高为主的独特蛋白表达谱，伴随p53升高，且BCL2与EV无独立关联。未来研究应优先进行cGAS–STING轴的功能评估（使用磷酸化STING、磷酸化TBK1、磷酸化IRF3和干扰素刺激基因读数），理想情况下覆盖已建立的cSCC、非肿瘤性EV皮肤和前驱病变；全面的β-HPV分型和病毒载量评估及TP53测序将阐明所观察表型的病毒和分子背景。cGAS–STING的药理学调节应在功能差异确立后才能进行研究。
