结直肠癌肝转移灶与原发肿瘤基因突变比较：来自小队列研究的启示

《Frontiers in Oncology》：Comparison of gene mutations of liver metastases to the primary tumor in colorectal cancer: lessons from a small cohort

　　

摘要专业翻译 引言： 前期分子诊断被用于表征结直肠癌的遗传特征，以指导治疗。由于结直肠癌通常经手术切除，这些样本被用于此类表征。肝转移灶在多大程度上维持原发肿瘤的遗传谱是一个关键问题。 方法： 本研究采用一个小型六例治疗前结直肠癌队列，通过靶向二代测序（next-generation sequencing, NGS）比较肝转移灶与原发肿瘤。 结果： 与既往报道相似，研究发现主要遗传驱动因素在肝转移灶中得以维持；然而，在这一水平上仍可检测到变化。研究人员还观察到，在大多数病例中，原发肿瘤的遗传谱在肝转移灶中部分或完全丢失。另一方面，研究人员检测到转移灶选择性出现的ABL1、HER2、RET、KIT、KDR和VHL突变。 讨论： 尽管本研究仅具有假说生成性质，但这些数据支持以下观点：与原发性肿瘤相比，结直肠癌肝转移灶的遗传分析可能识别出新的变异，这些变异可在疾病管理过程中被临床利用。

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一、研究背景与目的

肝脏是癌症转移扩散中最常受累的器官之一。由于解剖学特点，肝脏是消化道肿瘤血行播散（经门静脉引流）的第一过滤器官。然而，这只是癌细胞成功定植肝脏的必要条件之一：一方面，肝脏必须为定植的癌细胞提供支持性微环境；另一方面，癌细胞必须能够建立微转移灶，这依赖于癌细胞的遗传能力，如“干性”、增殖和抗凋亡策略。

长期以来，人们认为转移灶（包括肝转移灶）在驱动癌基因方面与原发肿瘤在遗传上非常相似，甚至完全相同。后来这一观点被重新定义，认识到原发肿瘤具有遗传异质性，只有部分亚克隆具有定植肝脏的能力。大规模结直肠癌肝转移基因组分析已证实，KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等主要癌基因以及P53、SMAD4、APC等抑癌基因均存在于肝转移灶中。然而，肿瘤进展（包括肝转移）存在五种不同的潜在遗传情景：线性克隆演化、平行演化、克隆消除、同克隆回归和分支演化。每种进展形式对转移灶相对于原发肿瘤的遗传组成都有不同影响。因此，基于原发肿瘤无法预测（肝）转移灶的遗传组成，只有直接评估才能揭示可能影响或决定临床决策和治疗策略的独特遗传特征。基于相对较小的配对队列研究发现，转移灶特异性基因变异的比例相对较低（19%），但另一项研究检测到个体病例中共享遗传变异的范围很广，从低（16.8%）到非常高的比例（86.8%）不等。因此，本研究在小型队列中检测了结直肠癌肝转移灶相对于其原发肿瘤的临床相关遗传变异，因为即使在今天，原发肿瘤仍是临床决策的信息来源。

二、研究设计与技术方法

研究人员从匈牙利国防军医疗中心收集了结直肠癌患者的临床数据，共收集10例接受肝转移灶手术切除患者的治疗前福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织样本，其中6例同时获得了相匹配的手术切除原发肿瘤的FFPE蜡块。研究经Semmelweis大学机构审查委员会批准。初始分子诊断包括KRAS外显子2突变检测和错配修复（mismatch repair, MMR）蛋白免疫组织化学分析。其余4例原发样本因质量原因不适合进行二代测序（NGS）分析。

测序采用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2（Thermo Fisher Scientific）50基因panel，涵盖ABL1、EGFR、GNAS、KRAS、PTPN11、AKT1、ERBB2、GNAQ、MET、RB1、ALK、ERBB4、HNF1A、MLH1、RET、APC、EZH2、HRAS、MPL、SMAD4、ATM、FBXW7、IDH1、NOTCH1、SMARCB1、BRAF、FGFR1、JAK2、NPM1、SMO、CDH1、FGFR2、JAK3、NRAS、SRC、CDKN2A、FGFR3、IDH2、PDGFRA、STK11、CSF1R、FLT3、KDR、PIK3CA、TP53、CTNNB1、GNA11、KIT、PTEN和VHL。在Ion PGM测序系统上进行测序，变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）灵敏度为5%，平均测序深度为200×。验证队列采用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）结直肠腺癌数据库和两个纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKC）结直肠癌队列共69例肝转移灶及其原发配对样本，通过cBioPortal在线工具分析35个选定基因的突变频率和类型。

三、研究结果

原发肿瘤与肝转移灶的突变谱比较

以15%的VAF截断值，NGS在原发肿瘤中检测到24个基因的突变，在肝转移灶中检测到29个基因的突变。所有突变的等位基因频率均未超过50% VAF。在本小队列中未检测到PTPN11、HNF1A、MPL、SMARCB1、JAK2/3、NPM、SMO、CDH1、SRC、CSF1、ALK、FLT3或CTNNB1基因突变。在原发肿瘤和肝转移灶中，最常见的突变位于抑癌基因P53、RB1、PTEN和APC以及KRAS癌基因（外显子3/4）中。值得注意的是，HRAS和BRAF突变仅在肝转移灶中发现。SMAD4和PIK3CA驱动突变在原发灶和转移灶中 prevalence 相似。MET突变仅存在于原发肿瘤中。肝转移灶选择性基因变异包括HER2、ERBB4、RET、KIT、ABL1和VHL突变。与TCGA/MSKC 69例肝转移数据集比较显示，KRAS和P53突变频率与本研究队列相似，但本研究小队列中大多数突变更为普遍。

配对样本的突变谱维持分析

研究人员比较了每例原发肿瘤与其对应肝转移灶的遗传谱，以评估谱维持程度。原发肿瘤中共检测到52个突变（约9个/样本）。在2例（P1和P4）中，原发肿瘤谱在肝转移灶中得以保留；在另外2例（P3和P5）中几乎完全丢失；其余2例（P2和P6）中显著改变。

肝转移灶特异性驱动模式分析

肝转移灶中共检测到56个突变（约8个/样本），与原发肿瘤的突变率相似。然而，大多数突变（30/56）为肝转移样本所独有。分析显示，部分病例（L1和L3）以新发突变为主，而部分病例（L2和L5）新发突变罕见或缺失。在L1病例中出现了NRAS突变，L3病例中出现了BRAF突变。PIK3CA突变分析显示，在原发肿瘤阳性的4例中，有3例该突变在肝转移灶中丢失；而在原发肿瘤阴性的2例肝转移灶中出现了新的PIK3CA突变。此外，对4例缺少原发肿瘤数据的肝转移灶（L7–L10）与配对样本的比较表明，除L7外，这些样本的突变模式与配对样本相似。

四、讨论与结论

本小队列的比较遗传分析表明，50基因panel的突变频率在原发肿瘤与肝转移灶之间非常相似，支持了先前大型病例系列的观察结果。主要抑癌基因和致癌驱动谱在肝转移灶中与原发肿瘤相似。然而，配对比较显示大多数肝转移灶突变是特异性的，提示原发肿瘤遗传谱频繁切换，这一发现出乎意料。MET突变仅见于原发肿瘤，而HER2、ERBB4、RET、KDR、KIT和ABL1在转移灶中更频繁检出。这些突变在本小队列中比TCGA数据集中更常见，可能归因于这些患者为同质族裔的匈牙利人，和/或该队列为KRAS外显子2野生型病例的独特性质。

本小病例系列提供的数据表明，肝转移灶的靶向测序可提供疾病进展过程中突变谱的额外信息，具有临床相关性。一方面，肝转移灶中可出现新的RAS突变，或KRAS突变可在转移灶中消失，两者均影响抗EGFR抗体治疗的适用性。此类变化预期发生在异时性转移中，但本研究观察到大多数发生在同时性转移中。对于病例3，转移灶中新的BRAF热点突变可能影响了西妥昔单抗的治疗。

值得注意的是，肝转移灶中新的VHL突变频率较高，伴或不伴KDR或PDGFRA突变——这些均为抗VEGF抗体或多激酶血管生成抑制剂疗效的预测标志物，进一步支持了病例1、4和9中贝伐珠单抗的使用。既往较大队列研究检测到VEGF-A和ANGP-2的过表达，提示缺氧信号通路上调。本研究观察到的频繁肝转移灶选择性VHL突变可能为此现象提供了遗传背景。PIK3CA突变在结直肠癌中相对常见，在肝转移灶中也较频繁，是其他癌种中已确立的PIK3CA抑制剂靶点。然而，该突变在转移灶中频繁丢失，又在原发灶阴性的肝转移灶中出现，再次证明了进展过程中的克隆切换。肝转移灶靶向测序还揭示了ABL、RET、KIT和FGFR的突变，这些在其他癌种中均为特定激酶抑制剂的确立靶点。根据欧洲肿瘤内科学会分子靶点临床可操作性量表（ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets, ESCAT）分级，这些均属于IIa和IIIa类。值得注意的是，这些“新发”肝转移突变在TCGA-MSKC数据集中通常罕见，提示即使在原发肿瘤测序之后，对肝转移灶进行重新测序也是一种具有临床相关性的策略。

既往关于结直肠癌肝转移进展的研究检测到转移灶相对于原发肿瘤的独特变异，涉及多种不被视为癌基因或抑癌基因的基因。此外，结直肠癌的共识分子亚型（consensus molecular subtype, CMS）谱在肝转移灶中与原发肿瘤不同。本研究小队列的发现仅具有假说生成性质，但可能推动更大队列的更系统分析以阐明这些问题。

研究结论： 结直肠癌肝转移灶的遗传分析可识别出相对于原发肿瘤的新变异，这些变异可在疾病管理过程中被临床利用。对肝转移灶进行靶向测序，即使在原发肿瘤测序之后，也可能提供临床相关的额外信息，包括影响抗EGFR治疗适用性的RAS/BRAF状态变化、支持抗VEGF治疗选择的VHL突变，以及可作为其他癌种中已确立靶点的激酶基因突变。