Env-gp120 β20-β21中E433位点的自然变异与V2和gp41突变协同调节HIV-1感染性

《Frontiers in Microbiology》：Natural variations at the E433 site in Env-gp120 β20-β21 cooperate with V2 and gp41 mutations to modulate HIV-1 infectivity

　　

HIV-1感染始于Env-gp120与CD4受体的结合，以及CD4触发的Env构象变化，这些变化使病毒得以进入细胞。为鉴定调节Env-CD4相互作用的Env关键位点，研究人员分析了通过在体外传代一个携带来自临床分离株CRF08_BC的CCR5嗜性env基因、复制能力弱的HIV-1克隆所获得的生长增强适应性突变体。对测试的四个适应克隆进行测序，发现了多个Env突变，其中包括在C4域β₂₀-β₂₁发夹结构内gp120残基E433的反复替换。通过使用嵌合前病毒和病毒突变克隆，研究人员发现病毒感染性增强需要Env突变的特定组合。在一个适应克隆中，V2域的四氨基酸缺失、E433K以及gp41中导致胞质尾C端截短的双核苷酸插入协同作用：只有三重组合才能重现适应病毒的高感染性。在另一个适应克隆中，虽然V2域中的D166N和N195K替换单独作用不足，但将E433K突变添加到这两个突变中显著提高了病毒感染性。在各点突变中，D166N降低了感染性，而N195K增加了感染性。E433K单独基本无效应，但补偿了D166N缺陷并增强了N195K效应。在433位点引入正电荷强烈增强了病毒感染性：E433R单独使感染性提高约5倍，并与D166N+N195K显著增强感染性，而E433G影响甚微。携带D166N+N195K和/或E433R的突变体对可溶性CD4（soluble CD4, sCD4）的敏感性增加，与CD4触发的Env响应增强一致。相反，CCR5拮抗剂时间添加进入试验显示与CCR5接合的进程相似，提示改善的是进入产量而非更快的进入动力学。中和谱分析提示有限的整体三聚体重塑，突变依赖性的变化出现在V1/V2和V3-聚糖导向抗体，但对CD4结合位点抗体影响很小。计算机模拟（in silico）gp120-CD4分析支持这一观点，涉及其中的原体间V2接触和CD4界面上E433的正电荷效应。总之，这些结果确定C4域β₂₀-β₂₁发夹中的E433是一个静电调节位点，与V2和gp41变化协同增加有效进入。

**研究背景与问题**

HIV-1进入宿主细胞始于包膜糖蛋白gp120（Env-gp120）与CD4受体结合，随后CD4触发Env发生构象变化，使病毒能够与辅助受体CCR5/CXCR4结合并介导膜融合。Env以三聚体形式存在，由受体结合亚基gp120和跨膜亚基gp41组成。CD4结合诱导Env从融合前关闭状态向开放状态转变，该过程中V1V2环、V3环以及C4结构域内的β₂₀-β₂₁链发生显著重排。尽管已知CD4接触位点广泛分布于gp120，但β₂₀-β₂₁发夹是重要的功能区域。同时，gp41的多个元件（如HR1/HR2、胞质尾等）也调节病毒感染性和融合能力，gp120与gp41之间及Env内部各结构域间的串扰可影响CD4诱导的构象变化，但决定Env-CD4有效结合与感染性的具体序列因素尚未完全阐明。为鉴定调控Env-gp120/gp41结构域偶联和CD4触发构象动态的关键位点，研究人员采用体外适应策略，通过长期培养复制能力弱的病毒，筛选获得生长增强的适应性突变体，进而解析Env各结构域间的协同机制。

**研究内容与结论**

研究人员利用携带来自临床分离株CRF08_BC的CCR5嗜性env基因、复制能力弱的HIV-1克隆（Y3）进行长期体外培养，分离出四个生长增强的适应克隆（Y3ad-2、-6、-7、-8），测序发现所有克隆均存在gp120 C4结构域β₂₀-β₂₁内的E433K突变。通过嵌合前病毒克隆和定点突变分析，在Y3ad-6中鉴定出V2区四氨基酸缺失（STEEdel）、E433K和gp41双核苷酸插入（导致胞质尾C端截短）的三重组合是重现适应病毒高感染性所必需的。在Y3ad-2中，V2区D166N和N195K单独不足以增强感染性，加入E433K后显著提高感染性；E433K单独几乎无效应，但能补偿D166N的缺陷并增强N195K的作用。进一步探究433位点氨基酸性质的影响，发现引入正电荷残基（E433R）可单独将感染性提高约5倍，并与V2突变协同显著增强感染性，而E433G无影响。sCD4敏感性试验显示，携带D166N+N195K和/或E433R的突变体对sCD4更敏感，提示Env-CD4相互作用增强；而CCR5拮抗剂TAK-779时间添加试验显示各变异株进入动力学相似，表明提高的是进入产量而非更快的进入速率。中和抗体谱分析显示，V2突变增加PG16敏感性，E433R增加PGT128敏感性，而CD4结合位点