《Frontiers in Immunology》：Sleep fragmentation frequency is associated with distinct immune, microbial, and barrier-related profiles in DSS-induced colitis in mice
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背景：睡眠碎片化（Sleep fragmentation, SF）在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）中常见，但不同碎片化频率是否与结肠炎期间不同的生物学应答相关仍不清楚。本研究探讨了DSS（Dextran sod
背景：睡眠碎片化（Sleep fragmentation, SF）在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）中常见，但不同碎片化频率是否与结肠炎期间不同的生物学应答相关仍不清楚。本研究探讨了DSS（Dextran sodium sulfate，葡聚糖硫酸钠）诱导的小鼠结肠炎中对低频率和高频率睡眠碎片化的终点特异性应答。方法：雄性C57BL/6小鼠分为对照组（Control）、DSS组、DSS联合低频率睡眠碎片化组（DSS+LSF）、DSS联合高频率睡眠碎片化组（DSS+HSF）或单独高频率睡眠碎片化组（HSF）。通过饮用含2% DSS的水连续7天诱导结肠炎。睡眠碎片化于光照期每日实施12小时，LSF为60次清扫/小时，HSF为240次清扫/小时。评估指标包括临床指数、组织学、上皮屏障相关蛋白、炎症和应激相关标志物、结肠CD4+ T细胞亚群、粪便微生物群组成及粪便短链脂肪酸（Short-chain fatty acids, SCFAs）。结果：临床和宏观指标在各实验组间存在差异，但DSS处理组之间的校正比较未达到统计学显著性。血浆皮质酮（Corticosterone）在DSS+LSF组和DSS+HSF组均升高，而髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）水平在DSS+LSF组高于DSS+HSF组。结肠Th2细胞比例在DSS+HSF组高于DSS组和DSS+LSF组。其他组织学、屏障相关、炎症和代谢方面的发现主要为描述性结果。结论：低频率和高频率睡眠碎片化与DSS诱导结肠炎期间不同的、终点特异性的应答特征谱相关，而非简单地线性加重疾病严重程度。这些发现支持频率相关的域特异性应答模式，值得进一步的纵向和机制研究。
**论文解读**
**一、研究背景与问题提出**
炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD，一组以肠道慢性复发性炎症为特征的疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病）的发病机制涉及遗传易感性、环境触发因素、肠道微生物群（Gut microbiota）、上皮屏障功能障碍及黏膜免疫失调之间复杂的交互作用。尽管生物制剂和小分子药物取得了显著进展，症状负担和反复发作仍十分普遍，凸显了识别影响肠道炎症和宿主恢复能力的可调控因素的重要性。
睡眠障碍作为IBD中日益受到关注的共病，其临床意义已获得广泛认可。荟萃分析显示，超过半数IBD患者存在睡眠质量不佳，且客观疾病活动指标与睡眠障碍的患病率呈正相关。值得注意的是，即使排除夜间胃肠道症状的干扰，系统性炎症标志物（如C反应蛋白升高）仍与睡眠质量下降独立相关。客观多导睡眠监测进一步揭示，即便在临床缓解期IBD患者中亦可观察到睡眠碎片化（Sleep fragmentation，指反复短暂觉醒导致睡眠连续性中断的现象）。流行病学前瞻性队列研究同样表明，基线睡眠障碍可预测克罗恩病后续疾病活动风险，而睡眠时长异常与溃疡性结肠炎的发病风险增加相关。这些临床证据促使研究人员通过实验研究阐明特定睡眠表型——尤其是睡眠碎片化——如何调控肠道炎症。
然而，既往临床前研究多将单一睡眠干扰方案与对照组进行比较，忽略了"不同频率的睡眠碎片化是否与差异化的临床、炎症、微生物、代谢和屏障相关终点特征谱相关联"这一关键问题。本研究正是针对这一空白，利用DSS诱导结肠炎模型（一种广泛使用的模拟溃疡性结肠炎上皮损伤和肠道炎症的动物模型），系统比较低频率与高频率睡眠碎片化对多维度终点指标的影响。
**二、研究概述与意义**
研究人员将雄性C57BL/6小鼠随机分为五组：对照组（Control）、DSS诱导结肠炎组（DSS）、DSS联合低频率睡眠碎片化组（DSS+LSF，60次清扫/小时）、DSS联合高频率睡眠碎片化组（DSS+HSF，240次清扫/小时）以及单独高频率睡眠碎片化组（HSF）。经过7天实验周期后，从临床疾病指标、组织病理学、上皮屏障相关蛋白表达、炎症及应激标志物、结肠CD4
+ T细胞亚群分布、粪便微生物群组成和粪便短链脂肪酸（Short-chain fatty acids, SCFAs，肠道微生物发酵膳食纤维产生的小分子代谢物，对维持肠道健康至关重要）谱等多个维度进行系统评估。
该研究的核心发现是：低频率和高频率睡眠碎片化并未产生简单的线性疾病加重效应，而是在不同生物学终点上表现出差异化、域特异性的应答模式。经多重比较校正后，两种碎片化方案均伴随血浆皮质酮显著升高；MPO（髓过氧化物酶，反映中性粒细胞浸润的指标）在DSS+LSF组更为突出；结肠Th2细胞比例和加权UniFrac距离指标（一种衡量微生物群落结构差异的系统发育度量方法）则在DSS+HSF组更为显著。组织学损伤、屏障相关蛋白表达、炎症介质和粪便SCFA谱则呈现额外的描述性差异。该研究首次在IBD背景下揭示了睡眠碎片化频率对多系统生物学应答的差异化影响，为理解睡眠障碍与IBD之间的复杂交互提供了新的视角，也为后续纵向机制研究奠定了重要基础。
**三、关键技术方法**
本研究采用DSS诱导的急性结肠炎模型，以2% DSS饮用水连续处理7天。睡眠碎片化通过电机驱动扫杆系统实现，于光照期（08:00–20:00）每日实施12小时，LSF和HSF分别对应60次/小时和240次/小时的清扫频率。结肠炎严重程度通过体重变化、疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）和结肠长度等指标评估。组织病理学采用H&E染色和六域评分系统。上皮屏障相关蛋白（闭合蛋白OCLN、紧密连接蛋白TJP-1和水通道蛋白AQP4）通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）定量。应激和炎症标志物包括血浆皮质酮和CRP的ELISA检测、结肠细胞因子23重免疫分析、以及组织MPO测定。结肠CD4
+ T细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg）通过流式细胞术分析。粪便微生物群采用16S rRNA基因V3-V4区测序，数据经QIIME2处理，使用DADA2进行ASV推断，并通过加权UniFrac距离和LEfSe等方法进行多样性和差异丰度分析。粪便SCFAs采用GC-MS定量。统计方法以Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较校正为主。
**四、主要研究结果**
**4.1 临床与宏观指标在DSS结肠炎期间呈现组间变异**
DSS处理小鼠表现出进行性体重下降和DAI升高，结肠缩短在DSS+HSF组描述性上更为明显。五组间在第七天体重变化、DAI曲线下面积（AUC）和结肠长度方面均存在显著的总体差异，但DSS处理组之间经Dunn校正后的预设成对比较均未达到统计学显著性。这表明睡眠碎片化频率对临床疾病严重程度的修饰效应在统计学上尚不明确，主要表现为总体变异而非明确的组间差异。
**4.2 DSS+LSF组在DSS处理组中呈现最突出的描述性组织学损伤**
H&E染色显示，对照组和HSF单独组保持相对完好的隐窝结构和杯状细胞形态，而DSS处理组均表现出杯状细胞耗竭、炎症细胞浸润、黏膜增厚和结构破坏等上皮损伤特征。在DSS处理组中，DSS+LSF组的描述性组织学损伤评分最高，代表性切片中也显示出更明显的黏膜炎症损伤。然而，经Dunn多重比较校正后，DSS、DSS+LSF和DSS+HSF组之间的成对比较未保持统计学显著性。
**4.3 DSS+HSF组呈现屏障相关蛋白表达的描述性降低**
免疫组织化学定量结果显示，DSS处理组间OCLN、TJP-1和AQP4的染色呈现描述性变异。DSS+HSF组中OCLN和TJP-1染色似乎低于其他DSS处理组，暗示高频率碎片化可能对紧密连接蛋白表达产生更明显的影响。AQP4染色在各组间也有波动，但未见清晰的频率特异性模式。经Dunn校正后，三种蛋白的组间比较均未达到统计学显著性，提示屏障相关变化应被视为探索性发现。
**4.4 睡眠碎片化在DSS结肠炎期间升高皮质酮水平，而MPO在不同碎片化频率间存在差异**
血浆皮质酮浓度在DSS+LSF和DSS+HSF组均显著高于DSS单独组（校正p值分别为0.0062和0.0059），但两种频率之间无显著差异，表明两种碎片化方案均能激活应激应答，但不存在简单的频率依赖性皮质酮梯度。在结肠炎症介质中，DSS+LSF组IL-6和MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）显示描述性升高，但经校正后未达显著性。MPO是唯一在碎片化频率间保持显著校正差异的炎症标志物，DSS+LSF组显著高于DSS+HSF组（校正p=0.0009），提示低频率碎片化可能与更突出的中性粒细胞相关炎症活性相关联。CRP、IL-1β、IL-17A和嗜酸细胞趋化因子（Eotaxin）等指标的组间比较均未达到统计学显著性。
**4.5 高频率睡眠碎片化与DSS结肠炎期间结肠Th2比例升高相关**
流式细胞术分析显示，在结肠CD4
+ T细胞亚群中，Th2是唯一在DSS处理组间保留显著校正差异的亚群。DSS+HSF组Th2比例显著高于DSS单独组和DSS+LSF组，而DSS组与DSS+LSF组间无显著差异。Th1、Th17和Treg细胞在各DSS处理组间均呈现描述性变异，Th1和Th17未达显著差异，Treg比例在DSS+LSF和DSS+HSF之间虽有数值上的分离，但经校正后同样未达显著性。综合MPO和Th2的结果，免疫相关终点因碎片化频率不同而呈现差异模式：MPO在DSS+LSF组更为突出，Th2比例则在DSS+HSF组更为显著。
**4.6 DSS+HSF在DSS结肠炎期间呈现独特的加权UniFrac距离特征**
16S rRNA基因测序分析显示，Shannon多样性和物种丰富度在组间呈现描述性变异，DSS+HSF组的数值高于DSS+LSF组，但经校正后未达显著性。加权UniFrac距离指标方面，DSS+HSF组显著高于DSS单独组（p=0.0064），DSS与DSS+LSF之间以及DSS+LSF与DSS+HSF之间则未达显著性。LEfSe生物标志物分析揭示了各组特异的微生物分类学特征：对照组富集Muribaculaceae及相关拟杆菌门（Bacteroidota）谱系；DSS组富集疣微菌门（Verrucomicrobiota）相关特征，包括阿克曼菌科/阿克曼菌属（Akkermansiaceae/Akkermansia）；DSS+LSF组富集拟杆菌科/拟杆菌属（Bacteroidaceae/Bacteroides）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相关分类群；DSS+HSF组判别性分类群较少，其中梭菌目细菌（Clostridales bacterium）为显著特征之一。上述结果共同表明，睡眠碎片化条件与不同的微生物群落特征谱相关，而非产生简单的分级性菌群失调。
**4.7 粪便SCFA谱在不同DSS和睡眠碎片化条件下呈现描述性差异**
DSS暴露与多种SCFA的广泛描述性降低相关。与DSS单独组相比，DSS+LSF组主要SCFA（包括乙酸盐和丙酸盐）水平数值上更低。DSS+HSF组多种SCFA（包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐和3-甲基丁酸盐）水平相对于DSS+LSF组较高。在HSF单独组中，乙酸盐和丙酸盐数值上降低，而甲酸盐和丁酸盐则似乎较高。这些SCFA发现被定位为终点代谢物模式描述，而非经统计校正确认的组间差异。
**五、讨论总结与研究结论**
综合上述发现，本研究揭示了睡眠碎片化频率在多维度生物学终点上的非平行、域特异性应答模式。在应激应答轴上，两种碎片化频率均导致皮质酮升高，但未呈现频率依赖性梯度；在炎症效应上，MPO在低频率碎片化中更为突出，而Th2免疫应答偏向在高频率碎片化中更为显著；在微生物群落层面，加权UniFrac距离在高频率碎片化中显著区别于单纯DSS处理；而在组织学损伤、屏障蛋白表达、其他炎症介质和SCFA谱方面，仅观察到描述性差异。这种不同生物学域之间的解离现象，可能反映了应激、炎症、上皮和微生物-代谢域在应对不同频率睡眠中断时具有不同的时间动力学特征和信号通路参与，而非一个统一的疾病严重程度谱。
研究也存在若干局限：睡眠结构未通过脑电图/肌电图直接测量，LSF和HSF仅代表装置定义的干扰频率；终点设计限制了对各域之间时间序列关系的推断；16S rRNA测序不能直接确定微生物功能，粪便SCFA仅测定终点水平；有效样本量因技术质控在各检测项目中存在差异，多项发现经多重比较校正后未保持显著性；仅使用雄性小鼠，未评估性别依赖性应答；缺乏LSF单独对照组也限制了对低频率碎片化独立效应的评估。
**研究结论翻译**：总之，低频率和高频率睡眠碎片化与DSS诱导结肠炎期间不同的、终点特异性的应答特征相关，而非简单地线性加重疾病严重程度。经多重比较校正后，两种碎片化方案均与皮质酮升高相关，而MPO在DSS+LSF组更为突出，Th2比例和加权UniFrac距离指标在DSS+HSF组更为显著。组织学损伤、屏障相关蛋白表达、炎症介质和粪便SCFA谱在不同碎片化条件下显示出额外的描述性差异。综合而言，这些发现表明睡眠碎片化频率可能以域特异性的方式塑造炎症、免疫、微生物、代谢和屏障相关应答。需要进一步的纵向和机制研究，结合客观睡眠监测，以确定这些差异化应答模式背后的因果关系。
